NextGeneDx. Resultados de utilidad clínica.

NextGeneDx® Paneles multigen para el análisis genético de enfermedades heterogéneas mediante Next Generation Sequencing.

Resultados de utilidad clínica.

INTRODUCCIÓN Las tecnologías de secuenciación masiva o Next Generation Sequencing (NGS) permiten la obtención de millones de secuencias de ADN de forma simultánea en tiempos y costes muy reducidos. Hoy es posible combinar la extraordinaria eficiencia de estas herramientas con las técnicas existentes para explotar toda su utilidad en aplicaciones diagnósticas. En DNA Alliance hemos incorporado las grandes ventajas de la NGS al estudio de las regiones genómicas asociadas a enfermedades genéticamente heterogéneas. Realizamos la secuenciación completa y dirigida de todos los exones y regiones intrónicas adyacentes en los genes implicados. Los resultados obtenidos poseen utilidad clínica ya que el 100% de las regiones codificantes está representado con una cobertura mínima de 100x.

De Sanger a NGS

UTILIDAD CLÍNICA

Aplicando nuestra amplia experiencia en el diagnóstico clínico de las enfermedades genéticas, hemos desarrollado nuevos servicios diagnósticos basados en NGS para el análisis de varios genes de forma específica, completa y simultánea. Estos servicios han sido registrados por Imegen como NextGeneDx®

El diseño de cada uno de los genes se realiza de manera específica para obtener toda la información genómica de utilidad clínica para cada caso y excluyendo la información genómica del resto de regiones.

Los criterios seguidos para su diseño son: 1) Obtener una sensibilidad y especificidad diagnóstica comparable a las técnicas de Sanger (actual gold standard ).

Nuestros genetistas acreditados elaboran un informe de resultados detallado, siguiendo las normas internacionales de calidad. El informe incluye una interpretación de acuerdo con la indicación clínica del estudio.

2) Garantizar la representatividad del 100% de las regiones codificantes, y de las regiones intrónicas adyacentes de todos los genes de interés. 3) Reducir la información genómica “no útil” para cada problema clínico minimizando la incertidumbre diagnóstica y la información éticamente susceptible.

VENTAJAS 1. Diseño definido y orientado a cuestiones clínicas concretas, reduciendo la incertidumbre diagnóstica y por tanto, incrementando su utilidad clínica. 2. Alta resolución y cobertura (>100x) de todas las regiones codificantes de los exones implicados, así como las regiones intrónicas adyacentes (> 20 bp). 3. Especificidad y robustez comparables a Sanger y una sensibilidad superior, ya que permite detectar mosaicismos. 4. Análisis e interpretación de resultados utilizando procedimientos bioinformáticos específicos para cada enfermedad, grupo de genes y tipo de mutaciones. 5. Comprobación mediante Sanger de todos aquellos cambios patológicos detectados, así como regiones no cubiertas o con profundidades de lectura inferiores a 100x. 6. Versatilidad. La aproximación tecnológica utilizada y el know how adquirido nos permite desarrollar nuevos servicios basados en NGS adaptándonos a las necesidades de nuestros clientes.

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RESUMEN INFORME DE VALIDACIÓN La validación de los nuevos servicios basados en NGS se ha dirigido a la comparación de la secuenciación de ADN empleando el método de Sanger frente a la secuenciación empleando el equipo MiSeq de Illumina (NGS). Los procedimientos previos a la secuenciación de ADN son comunes a ambas técnicas. Tanto la extracción de ADN como la amplificación específica, mediante PCR, de los genes implicados en cada enfermedad son técnicas previamente validadas en nuestro laboratorio. Para la validación se han seleccionado muestras de las enfermedades más frecuentes para cuyo diagnóstico genético es necesaria la secuenciación de genes de gran tamaño. Se han analizado las secuencias obtenidas a partir de 48 muestras de ADN diferentes, compuestas

por un total de 96 genes. En total se han secuenciado, empleando la tecnología de Sanger y la de NGS, más de 3.400 amplicones (más de 1.200 diferentes entre sí). Tras el análisis de las secuencias obtenidas mediante la técnica de NGS, y su comparación con las secuencias obtenidas mediante la técnica Sanger, hemos podido concluir que detectamos todos los cambios y en ningún caso hemos obtenido nuevos cambios con una significatividad suficiente para requerir una posterior confirmación por Sanger. Tras la validación, el procedimiento establecido por nuestro laboratorio establece que todos los cambios patológicos que encontremos empleando técnicas de NGS, serán confirmados mediante Sanger.

Conclusión: En total han sido validados más de 900 cambios nucleotídicos. Se han detectado cambios de todo tipo: sustituciones nucleotídicas, inserciones y deleciones. Los cambios analizados se encontraban tanto en homocigosis como en heterocigosis.

A)

B)

C)

Figura 1: A) Vista general de los resultados obtenidos mediante NGS para el gen COL2A1. Las barras verticales superiores indican la presencia de cambios respecto a la secuencia de referencia. La zona central muestra cada una de las secuencias obtenidas alineadas frente a la secuencia de referencia. En la parte inferior se muestra un esquema con la distribución de algunos de los exones del gen COL2A1. B) Detalle del polimorfismo c.1836T>C (rs41317939) detectado en heterocigosis mediante NGS y mediante Sanger. C) Detalle de la deleción de una G (c.1313del). Esta mutación produce un cambio de la pauta de lectura y la aparición de un codón de parada prematuro a nivel de la proteína (p.Gly438AlafsX191).

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NextGeneDx® SERVICIOS DE DIAGNÓSTICO GENÉTICO MEDIANTE NGS • Albinismo GPR143, TYR, OCA2, MITF. NextGeneDx, secuenciación completa • Alport, síndrome COL4A3, COL4A4. NextGeneDx, secuenciación completa COL4A5, COL4A3, COL4A4. NextGeneDx, secuenciación completa • Alport, síndrome (Ligado al X) COL4A5. NextGeneDx, secuenciación completa • Alzheimer, enfermedad APOE, APP, PSEN1, PSEN2. NextGeneDx, secuenciación completa • Angelman-Like, síndrome UBE3A, MECP2, CDKL5, ZEB2, SLC9A6. NextGeneDx, secuenciación completa • Ataxia Episódica tipo 2 CACNA1A. NextGeneDx, secuenciación completa • Ataxia Telangiectasia ATM. NextGeneDx, secuenciación completa • Bartter, síndrome SLC12A1, KCNJ1. NextGeneDx, secuenciación completa • Cáncer Colorrectal Hereditario no Polipósico (HNPCC) MLH1, MSH2, MSH6. NextGeneDx, secuenciación completa • Cáncer de Mama Familiar BRCA1, BRCA2. NextGeneDx, secuenciación completa • Charcot-Marie-Tooth, síndrome PMP22, MPZ, NEFL, MFN2, MTMR2, GARS, GDAP1, PRX, GJB1, DNM2. NextGeneDx, secuenciación completa • Cohen, síndrome VPS13B. NextGeneDx, secuenciación completa • Colestasis Intrahepática Familiar Progresiva ABCB11, ABCB4, ATP8B1. NextGeneDx, secuenciación completa • Convulsiones Neonatales-Infantiles Benignas Familiares SCN2A, PRRT2, KCNQ2, KCNQ3. NextGeneDx, secuenciación completa • Coreoacantocitosis (Neuroacantocitosis) VPS13A. NextGeneDx, secuenciación completa • Cornelia de Lange, síndrome NIPBL, SMC1A, SMC3. NextGeneDx, secuenciación completa 4

• Craneosinostosis FGFR3, FGFR2, FGFR1, TWIST1, EFNB1. NextGeneDx, secuenciación completa • Diabetes MODY HNF4, GCK, HNF1A, HNF1B. NextGeneDx, secuenciación completa • Displasia Arritmogénica del Ventrículo Derecho DSG2, DSP, PKP2. NextGeneDx, secuenciación completa DSC2, DSG2, DSP, JUP, PKP2, RYR2 (30 exones), TGFB3. NextGeneDx, secuenciación completa PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Displasia Ectodérmica TP63, EDA, EDAR, EDARADD, WNT10A. NextGeneDx, secuenciación completa • Displasias Esqueléticas COL2A1, FGFR3, SLC26A2, COL1A2, COL1A1, CRTAP, SOX9, ALPL, LEPRE1. NextGeneDx, secuenciación completa FGFR2, COMP, COL11A1, COL11A2, EVC, TRIP11, EVC2. NextGeneDx, secuenciación completa PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Distrofia de Conos-Bastones ABCA4, GUCY2D, CRX. NextGeneDx, secuenciación completa • Distrofia Muscular Congénita con Déficit de Merosina LAMA2. NextGeneDx, secuenciación completa • Distrofia Muscular de Cinturas tipo 1 LMNA, CAV3, MYOT, DES. NextGeneDx, secuenciación completa • Distrofia Muscular de Cinturas tipo 2 CAPN3, DYSF, FKRP, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, FKTN, TCAP, ANO5. NextGeneDx, secuenciación completa • Distrofia Muscular de Duchenne-Becker DMD. NextGeneDx, secuenciación completa • Ehlers-Danlos, síndrome COL3A1, COL5A1, COL5A2. NextGeneDx, secuenciación completa • Ehlers-Danlos, síndrome tipo I/tipo II (Clásico) COL5A1, COL5A2. NextGeneDx, secuenciación completa • Ehlers-Danlos, síndrome tipo III COL3A1. NextGeneDx, secuenciación completa • Ehlers-Danlos, síndrome tipo IV (vascular) COL3A1. NextGeneDx, secuenciación completa

NextGeneDx® SERVICIOS DE DIAGNÓSTICO GENÉTICO MEDIANTE NGS • Enfermedad Aórtica TGFBR1, TGFBR2, FBN1, ACTA2, FBN2, ELN, TGFBR3. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Epidermolisis Bullosa Juntural con Atresia Pilórica ITGB4. NextGeneDx, secuenciación completa • Epilepsia Generalizada con Crisis Febriles Plus (GEFS) SCN1A, SCN1B, GABRG2, GABRD, SCN9A. Secuenciación completa mediante NGS • Epilepsias Infantiles SCN1A, ARX, CDKL5, SLC2A1, STXBP1, SCN2A, KCNQ2, CHRNA4, CHRNB2, CHRNA2, PCDH19, KCNQ3. Secuenciación completa mediante NGS MECP2, SCN1B, GABRG2, LGI1, POLG, POLG2, SLC25A22, SPTAN1, SRPX2. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Esclerosis Lateral Amiotrófica SOD1, FUS, TARDBP, ANG, C9orf72. NextGeneDx, secuenciación completa • Esclerosis Tuberosa TSC1, TSC2. NextGeneDx, secuenciación completa • Fiebres Familiares Recurrentes MEFV, TNFRSF1A, MVK, NLRP3. NextGeneDx, secuenciación completa • Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria NPHS2, NPHS1, ACTN4. NextGeneDx, secuenciación completa • Hiperglicinemia no Cetósica GLDC, AMT. NextGeneDx, secuenciación completa • Hipertermia Maligna RYR1. NextGeneDx, secuenciación completa • Hipertrigliceridemia LPL, APOA5, LIPI, GPIHBP1, APOC2, USF1. NextGeneDx, secuenciación completa • Hipoacusia no Sindrómica OTOF, GJB3, GJB2, GJB6. NextGeneDx. Secuenciación completa y detección de las mutaciones m.3243A>G, m.1555A>G, m.1494C>T, m.1095T>C, m.1095T>C, m.961delInsC, m.961T>C, m.7445A>G y m.7445A>C • Hipotiroidismo Congénito TPO, THRB, TG, TSHR. NextGeneDx, secuenciación completa

• Ictiosis Congénita Autosómica Recesiva TGM1, ALOX12B, ALOXE3, ABCA12, NIPAL4, CYP4F22, PNPLA1. NextGeneDx, secuenciación completa • Joubert, síndrome TMEM216, AHI1, NPHP1, CEP290, TMEM67, RPGRIP1L, ARL13B, CC2D2A, OFD1, CEP41, TMEM237. NextGeneDx, secuenciación completa • Kabuki, síndrome MLL2. NextGeneDx, secuenciación completa • Marfan, síndrome FBN1, TGFBR2. Secuenciación completa mediante NGS FBN1, TGFBR1, TGFBR2. NextGeneDx, secuenciación completa • Marfan-Like, síndrome COL3A1, COL5A1, TGFBR2, FBN1, COL5A2, ACTA2, MYH11, FBN2, SLC2A10, SMAD3, CBS, TGBR1. NextGeneDx, secuenciación completa • Marshall, síndrome de COL11A1. NextGeneDx, secuenciación completa • Miastenia Congénita CHRNA1, CHRNE, RAPSN, DOK7, COLQ, CHAT. NextGeneDx, secuenciación completa • Migraña Hemipléjica Familiar ATP1A2, CACNA1A, SCN1A. NextGeneDx, secuenciación completa CACNA1A. NextGeneDx, secuenciación completa • Miocardiopatía Dilatada LMNA, MYBPC3, MYH7, SCN5A, TNNI3, TNNT2. Secuenciación completa mediante NGS ACTC1, DES, LDB3, MYH6, PSEN1, PSEN2, TCAP, TNNC1, TPM1, VCL. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Miocardiopatía Hipertrófica MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL3, ACTC1. Secuenciación completa mediante NGS ACTC1, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, TCAP, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Miocardiopatía no Compacta ACTC1, DTNA, LDB3, LMNA, MYH7, TAZ, TNNT2. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa 5

• Miopatía Congénita MYH7, RYR1, ACTA1, TPM3, SEPN1. NextGeneDx, secuenciación completa • Miopatía Congénita Central Core RYR1. NextGeneDx, secuenciación completa • Miopatía Multiminicore RYR1, SEPN1. NextGeneDx, secuenciación completa • Nefronoptisis no Infantil NPHP1, CEP290, RPGRIP1L, GLIS2, NPHP4. NextGeneDx, secuenciación completa • Neurofibromatosis tipo 1 NF1. NextGeneDx, secuenciación completa • Noonan, síndrome PTPN11, RAF1, SOS1, KRAS, BRAF. NextGeneDx, secuenciación completa • Noonan-like, síndrome PTPN11, RAF1, SOS1, KRAS, NRAS, SPRED1, HRAS, MAP2K1, BRAF, MAP2K2, CBL, SHOC2. NextGeneDx, secuenciación completa • Osteogénesis Imperfecta COL1A1, COL1A2, CRTAP, LEPRE1. Secuenciación completa mediante NGS COL1A1, COL1A2. NextGeneDx, secuenciación completa • Pancreatitis Hereditaria CFTR, PRSS1, SPINK1, CTRC. NextGeneDx, secuenciación completa • Poliquistosis Renal Autosómica Recesiva PKHD1. NextGeneDx, secuenciación completa • QT largo, síndrome KCNH2, KCNQ1, SCN5A. Secuenciación completa mediante NGS CAV3, KCNE1, KCNE2, KCNH2, KCNQ1, SCN5A. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • QT-Corto, síndrome KCNH2, KCNJ2, KCNQ1. Secuenciación completa mediante NGS PERSONALIZADO. NextGeneDx, secuenciación completa • Rubinstein-Taybi, síndrome CREBBP. NextGeneDx, secuenciación completa • Sotos, síndrome NSD1. NextGeneDx, secuenciación completa 6

• Stargardt, síndrome ABCA4. NextGeneDx, secuenciación completa • Stickler, síndrome COL11A1, COL11A2, COL2A1. NextGeneDx, secuenciación completa • Usher, síndrome tipo 2A USH2A. NextGeneDx, secuenciación completa

Nuestro catálogo se actualiza de forma constante; consulte nuestra web para conocer la lista completa de estudios disponibles www.dnaalliance.com

SERVICIO INTEGRAL

CÓMO SOLICITAR UN ESTUDIO

DNA Alliance le ofrece un Servicio Integrado de Diagnóstico Genético que incluye:

1. Introduzca sus claves en la aplicación informática de solicitud de análisis a través a nuestra página web www.dnaalliance.com o regístrese como cliente para obtener sus claves personales si es la primera vez que solicita análisis.

• Asesoramiento especializado para la selección del servicio de diagnóstico más adecuado. • Realización del bioinformático.

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genético

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• Elaboración de un informe de resultados acorde a la indicación clínica del estudio. • Resultados en plazos reducidos (consultar, dependiendo del tipo de estudio e indicación). Cuando hayamos finalizado el análisis de sus muestras, recibirá un email informándole de que ya dispone de los resultados. A partir de ese momento, podrá entrar en la aplicación con sus claves para visualizar/descargar los documentos.

2. Acceda a Petición de análisis y cumplimente los datos del formulario. El programa le devolverá un código con el que debe identificar cada muestra que registre. 3. Si lo requiere, consulte el protocolo recomendado para la toma y preparación de sus muestras. 4. Contacte con nosotros para que gestionemos la recogida de sus muestras. Adjúntenos cualquier dato clínico relevante para el estudio del caso, así como la documentación administrativa necesaria. 5. Acceda a la aplicación si desea conocer el estado de sus solicitudes en curso o consultar la fecha prevista de emisión del informe.

Tipos de muestra recomendados: El tipo de muestra recomendada es sangre periférica con EDTA. Por favor, contacte con nuestro laboratorio si dispone de un tipo de muestra diferente. • Obtenga 5-15 ml de sangre periférica utilizando tubos con EDTA. • Mantenga las muestras a temperatura ambiente hasta que efectuemos la recogida de las mismas. Si fuera necesario almacenar las muestras más de 72 horas tras la extracción, es importante que las mantenga refrigeradas (nunca las congele ni las conserve refrigeradas más de un mes). Si desea realizar un Diagnóstico Prenatal contacte previamente con nuestro laboratorio.

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MADRID Faraday, 7 28049 Madrid (España) +34 918 047 760 VALENCIA Agustín Escardino, 9 46980 Paterna (Valencia-España) +34 963 212 340

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