Relacionamento genético de espécies do gênero Philodendron (Araceae, Monocotyledoneae) através do marcador DAF (DNA Amplification Fingerprinting).

March 21, 2018 | Author: Martim Davi Barreto Alves | Category: N/A
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Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-graduação em Genética Nível Mestrado

Relacionamento genético de espécies do gênero Philodendron (Araceae, Monocotyledoneae) através do marcador DAF (DNA Amplification Fingerprinting).

Isaac Farias Cansanção

Recife, Março de 2008

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas Programa de Pós-graduação em Genética Nível Mestrado

Relacionamento genético de espécies do gênero Philodendron (Araceae, Monocotyledoneae) através da técnica de DAF (DNA Amplification Fingerprinting).

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Mestre em Genética.

Aluno: Isaac Farias Cansanção Orientadora: Dra Ana Maria Benko-Iseppon, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE.

Recife, Março de 2008

2

Cansanção, Isaac Farias. Relacionamento genético de espécies do gênero Philodendron (Araceae, Monocotyledoneae)

através

da

técnica

de

DAF

(DNA

Amplification

Fingerprinting). / Isaac Farias Cansanção. – Recife: O Autor, 2008.

77 folhas : il., fig. tab. map Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2008. Inclui bibliografia e anexo. 1. Philodendron – Floresta Amazônica 2. Meconostigma 3. DNA Amplification Fingerprinting (DAF) I. Título. 582.547.1 584.64

CDU (2.ed.) CDD (22.ed.)

UFPE CCB – 2008- 112

3

3

Aos meus pais: Antonio Teles Cansanção e Ana Farias Cansanção.

4

AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus, por tudo que acontece e aconteceu na minha vida. Aos meus pais, Antonio Teles Cansanção e Ana Farias Cansanção, que são minhas estrelas referenciais e nos quais me espelho a cada dia. Eles plantaram sinceridade, paz, dignidade, sensibilidade e sabedoria. Por todos os momentos, juntos ou separadamente, mesmo com motivos de força maior, souberam colocar na hora certa palavras de paciência, ajuda, fraternidade, carinho e um grande amor, sendo os únicos que sabem o que significa este sentimento. Pelos momentos árduos e conflitantes da minha vida, onde souberam usar perfeitamente as palavras, seja para me confortar, seja para alertar-me sobre minha vida. A meus pais, deixo os mais sinceros e eternos agradecimentos por todos os momentos proporcionados em todas as fases da minha vida, passando pela infância, adolescência e a fase adulta. Aos meus irmãos, Romero e Janaina, pelo apoio, força e incentivo dados durante esta caminhada. À minha orientadora Profa. Dra. Ana Maria Benko-Iseppon, pela orientação, pela confiança, exemplo de dedicação e momentos de aprendizagem, os quais foram determinantes na execução deste trabalho e para minha ascensão, tanto pessoal como também profissional. Dedico a ela toda minha gratidão. Aos amigos, mestrandos, doutorandos e companheiros de bancada Diego Sotero, Geyner Alves, Alberto Vinícus, Amaro e Maria Luciene, pela amizade, companheirismo, respeito, admiração, colaborações, incentivos, parcerias, momentos de descontrações tanto no laboratório como em diversos locais. Minha eterna saudade a todos. Ao super e inesquecível amigo Dr. Mário Correia, pelo seu companheirismo, transparência, profissionalismo, sinceridade e sensibilidade; pelos ensinamentos teórico-práticos, discussões, troca de idéias e apoio; como também não poderia esquecer de 2004, em pleno carnaval, quando ele se prontificou a me ajudar e me orientou com plena firmeza e satisfação. A você dedico não só minha eterna gratidão, mas também tudo o que aconteceu em minha estada em Recife, pois você soube me ajudar em momentos decisivos em toda minha vida profissional nesta cidade, lembranças que ficarão guardados enquanto viver. Aos demais amigos e companheiros que fizeram ou ainda fazem parte do Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, como Graduandos Analice, Thais Cavalcanti e Santelmo Selmo, Karla Camila e Rodrigo, como a graduada Kenia Lucena, das Mestrandas ou já Mestres Ana Carolina, Nina Mota, Hayana Azevedo, Luis Carlos Bellarmino e Lidiane Amorim e aos do Doutorado em Genética e Ciências Biológicas como Ebenezer Bernardes, 5

Kyria Bortoletti, Ronaldo Nali e Pedranne Barbosa pelos momentos de trabalho ou de divertimento, vocês sempre ficarão na minha memória. À técnica de laboratório Claudete Marques e aos estagiários Diego Valério e Derovil Santos, pelos auxílios, companheirismo e dedicação no que fazem, em que, com certeza, farão muita falta. Aos professores que lecionam no programa de Pós-graduação em Genética, pela participação na minha formação profissional. Ao Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho, por sua atenção, sinceridade, companheirismo e amizade. À Profa. Drª. Ana Christina Vidal (Depto. de Genética – UFPE), pelos auxílios, esclarecimentos prestados em momentos muito oportunos, participação e amizade. Aos colegas do Mestrado/2006, pelos ótimos momentos vividos juntos, em especial aos amigos Carlos José Saldanha e Neto Costa Ferreira, pelo companheirismo em situações boas ou árduas. Ao Departamento de Genética da UFPE, que dispôs de toda a infra-estrutura para que este trabalho fosse realizado. Aos funcionários, técnicos e ao todo corpo docente, meus sinceros agradecimentos. Em especial à Dona Zizi e a Romildo, pessoas da mais inteira confiança e dedicação em seus devidos trabalhos. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES por viabilizar a realização deste trabalho, concedendo uma bolsa de Mestrado. À Sâmia Régia, pelo apoio e ajuda dada para a realização deste trabalho. A todos os amigos, familiares e ex-professores que colaboram de alguma forma para que este sonho se concretizasse. Em especial, Silvânia Belo, Milena Cruz, Felipe, Riquinho, Paulinho Alecrim e seus respectivos pais, Anderson Lóssio, Moacyr Neto, Fábio e Fernando Santana, Felipe Silva, Maria do Carmo, Luisinho L., Alisson e Domingos Sávio Farias, Tibucio Alves, Estemar Velho e Profs. Henrique Douglas e Vicente Militão. A vocês deixo um forte abraço.

6

SUMÁRIO Pág •

DEDICATÓRIA

4



AGRADECIMENTOS

5



SUMÁRIO

7



LISTA DE FIGURAS

9



LISTA DE TABELAS

10



LISTA DE ABREVIATURAS

11



RESUMO

13



ABSTRACT

14

1. INTRODUÇÃO

15

2. REVISÃO DA LITERATURA

17

2.1 – Amazônia: Biodiversidade e Delimitação Geográfica

17

2.1.1 – Reserva Florestal Adolpho Ducke

18

2.1.1.1- Características Gerais

19

2.1.2 – Floresta Nacional do Caxiuanã e a Estação Científica Ferreira Penna

20

2.1.2.1 – Características Gerais

20

2.2 – Breve Histórico da Família Araceae

22

2.2.1- História do Gênero Philodendron

22

2.3 – Taxonomia e Botânica de Araceae

25

2.3.1 – Taxonomia e Botânica de Philodendron

27

2.4 – Importância Econômica

29

2.5 – Marcadores Moleculares em Vegetais

31

2.5.1. Análise de Marcadores e Geração de Dendrogramas

33

2.6 – Marcadores Moleculares em Araceae

34 37

3 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

7

44

4 – MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO: Folha de Rosto

46

Resumo

47

Introdução

48

Materiais e Métodos

49

Resultados e Discussão

53

Referências Bibliográficas

61

5 – CONCLUSÕES GERAIS

69

6 – ABSTRACT

70

7 – ANEXOS

71

7.1 - Instruções para Autores - Botanical Journal of the Linnean Society

72

8

LISTA DE FIGURAS

Revisão Bibliográfica Figura 1

Mapa destacando os Estados brasileiros que constituem a Amazônia Legal.

17

Figura 2

Foto satélite da Reserva Florestal Adolpho Ducke, localizada na periferia de Manaus, coordenadas 02º 53’ de latitude S e 59º 58’ de longitude W.

19

Artigo Científico Figura 1

Perfil de um gel de DAF utilizando os primers P15-1, OPJ-19, OPD-6 e OPK-4 em 8 acessos de Philodendron, Monstera e Dieffenbachia coletados das regiões da Amazônia e Mata Atlântica Brasileira.

62

Figura 2

Dendrograma gerado com base na seleção de primers. A análise foi feita pelo método UPGMA utilizando o programa MEGA 4 versão para Windows. Legendas: G1 e G2: espécies do gênero Philodendron; GE: Grupo externo: Dienffenbachia e Monstera.

62

Figura 3

Perfil de um gel de DAF utilizando o primer OPL-14 em 35 acessos de Philodendron, Monstera, Dieffenbachia e Scaphispata coletados das regiões da Amazônia e Mata Atlântica Brasileira.

63

Figura 4

Dendrograma gerado com Neighbour-Joining pelo programa MEGA 4 versão para Windows usando método DAF com 12 primers. Legendas: C: Clado, Sc: Subclado e Sg: Subgênero. GE1 e GE2: Grupos externos formados pelos Gêneros Dieffenbachia, Monstera e Scaphispata representados pelos números (1, 2, 3, 4 e 5). G1 e G2: Grupos 1 e 2 formados pelo gênero Philodendron, formando clados representados pelas letras maiúsculas (A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, L, M, e N) e subclados representados pelas letras minúsculas (a, a1, b, b1, c, c1, d, d1, e, e1, f, f1, g1, h1, i1, j1). Sg1: Subgênero Philodendron; Sg2: Subgênero Mecanostigma. A barra significa: escala de diversidade genética. Fonte dos números cromossômicos ocorrentes no gênero: Correia-da-Silva, et al. (2007) e * Mayo (apud Peterson, 1989).

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LISTA DE TABELAS

Artigo Científico Tabela 1

Material vegetal utilizado na análise molecular com DAF, incluindo local de coleta

65

e número de acesso. Todas as espécies foram coletadas no Brasil e atualmente estão sendo cultivadas na Universidade Federal de Pernambuco. Ordem taxonômica dividida em gênero e subgênero. Numeração na coluna de ordem em relação à figura 3. Abreviação: P.= Philodendron Schott; D.= Dieffenbachia. Fontes dos números cromossômicos ocorrentes no gênero: Correia-da-Silva, et al. (2007) e *Mayo (apud Peterson, 1989).

Tabela 2

Primers utilizados na seleção, incluindo seqüência e quantidade de bandas

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produzidas. Número de bandas específicas (intraespecífico, interespecífico e intergenérico) quanto ao nível (monomorfismo e polimorfismo). Primers sintetizados pela Operon Tecnologies.

Tabela 3

Primers selecionados para análise das 32 amostras selecionadas para este estudo, incluindo referência e seqüência dos mesmos. Análise feita a nível de polimorfismos dentro do gênero Philodendron e os demais gêneros.

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LISTA DE ABREVIATURAS

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados)

AM

Amazônia

A-T

Adenina-Timina

ca.

Cerca de

CTAB

Cetyl-trimethyl-amoniumbromide (brometo de cetil-trimetilamônio)

DAF

DNA Amplification Fingerprinting (Amplificação de fingerprinting de DNA)

DNA

Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico)

dNTP

Dinucleotídeo trifosfato

ECFPn

Estação Científica Ferreira Penna

G-C

Guanina-Citosina

IBAMA

Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis

INPA

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

kg

Quilograma

Km2

Quilômetro quadrado

m

Metros

MCT

Ministério da Ciência e Tecnologia

ME

Minimal Evolution

MEGA 4

Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Version 4.0)

mg

Miligrama

MgCl2

Cloreto de Magnésio

mL

Mililitros

mM

milimolar

MP

Máxima Parcimônia

MPEG

Museu Paraense Emílio Goeldi

ng

Nanogramas

NJ

Neighbor-joining

NTSys

Numerical Taxonomy And Multivariate Analysis System

OTU

Operational Taxonomic Unity (Unidade Taxonômica Operacional)

PA

Pará

pb

Pares de bases 11

PCR

Polymerase Chain Reaction (Reação polimerase em cadeia)

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA (Polimorfismo de DNA amplificado ao Acaso).

RFLP

Restriction fragment length polymorphism (Polimorfismo de comnprimento de fragmentos de restrição)

RNA

Ribonucleic Acid

Taq

Thermophylus aquaticus

UFPE

Universidade Federal de Pernambuco

UPGMA

Unwheited Pair Group Method with Arithmetic Mean

VNTR

Variable Number of Tandem Repeats (Número Variável de Repetições em Tandem)

µg

Micrograma

µL

microlitro

µM

micromolar

2n

Número cromossômico diplóide

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RESUMO

O gênero Philodendron (Araceae) apresenta destacada importância não apenas devido a seu contingente populacional, mas também pela ampla utilização ornamental, devido à beleza e diversidade de formas e cores de suas folhagens. Conta com aproximadamente 600 espécies já registradas, distribuindo-se endemicamente nas Américas e apresentando grande diversidade na região Amazônica na Mata Atlântica, onde os exemplares do presente estudo foram coletados. Marcadores DAF (DNA Amplification Fingerprinting) são úteis na geração de polimorfismos especialmente em nível intra e interespecífico, sendo informativos em análises de diversidade genética. No presente trabalhos 37 primers foram avaliados em uma amostragem inicial incluindo seis espécies de Philodendron (dois acessos de P. megalophyllum, e um acesso de cada espécie: P. imbe, P. ornatum, P. pedatum e P. sphalerum), bem como em dois táxons testados como grupo externo: Dieffenbachia elegans e Monstera dubia. A partir desta seleção, 12 iniciadores decâmeros foram selecionados como mais informativos. Em uma avaliação mais abrangente usando-se os primers selecionados, foram avaliados membros de 26 acessos de 18 espécies de Philodendron, comparados a representantes de Dieffenbachia (2 spp.) Monstera (3 spp.) e Scaphispatha (1 spp.). Todas as espécies de Philodendron estudadas pertencem ao subgênero Philodendron, com exceção de P. goeldi e P. solimoesense do sbg. Meconostigma. No total 1108 bandas polimórficas foram incluídas na matriz de dados para a geração do dendrograma usando o método de Neighbour-Joining (bootstrap de 1000 replicações, programa MEGA 4). O dendrograma foi associado a números cromossômicos das espécies analisadas, permitindo uma avaliação comparativa de tendências cariotípicas à luz dos grupamentos gerados pelos marcadores DAF. Espécies com 2n=32 agruparamse no dendrograma, enquanto espécies com 2n=30 e 34 uniram-se em um clado separado. Considerações adicionais sobre as relações reveladas no presente trabalho com relação ao sbg. Philodendron são também discutidas.

Palavras-chave: Philodendron, Meconostigma, DNA Amplification Fingerprinting, Floresta Amazônica, Mata Atlântica.

Email: [email protected]

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ABSTRACT

The genus Philodendron (Araceae) presents highlighted importance not only due to its populational abundance, but also because of its ornamental use, resulting from the diversity of its leaves shapes and colors. Counts with about 600 registered species, endemic in the Americas and with substantial diversity in the Amazon and Atlantic forests, where the presently studied material has been collected. DAF (DNA Amplification Fingerprinting) markers are useful to generate polymorphisms especially at intra- and interspecific levels, very informative in genetic diversity evaluation. The present work evaluated 35 primers in an initial sample including six Philodendron genotypes (two populations of P. megalophyllum, and a single population of each species: P. imbe, P. ornatum, P. pedatum and P. sphalerum), as well as two taxa, here tested as outgroups: Dieffenbachia elegans and Monstera dubia. After the selection step 12 decamers more informative primers were selected. In a most comprehensive evaluation using the selected primers, 26 populations out of 18 Philodendron species were analyzed, as compared with genotypes of Dieffenbachia (2 spp.) Monstera (3 spp.) and Scaphispatha (1 sp.), as outgroup candidates. All Philodendron species belonged to the large (and controversial) subgenus Philodendron, with exception of P. goeldi and P. solimoesense of sbg. Meconostigma. A total of 1108 polymorphic bands have been included in the data matrix for the generation of a dendrogram using Neighbour-Joining (bootstrap with 1000 replications, program MEGA 4). The generated dendrogram was associated with chromosome numbers of the analyzed species, permitting a comparative evaluation of caryological trends besides genetics relationships revealed by DAF. In general species with 2n=32 grouped together, while species with 2n=30 and 34 grouped in a separate clade. Further relationships revealed in the present work regarding the sbg. Philodendron are also discussed.

Key-words: Philodendron, Meconostigma, DNA Amplification Fingerprinting, Amazon rainforest, Atlantic forest.

Email: [email protected]

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1. INTRODUÇÃO

A família das Araceae Juss. pertence à classe das monocotiledôneas, estimando-se que compreenda 105 gêneros e 3.500 espécies. Sua distribuição mostra-se predominantemente tropical; entretanto, a família ocorre em todos os continentes, exceto na Antártida (Heywood, 1993; Mayo, et al., 1997). No Brasil, a família está representada por 30 gêneros e 402 espécies, representando mais de um terço de todos os gêneros da família (Mayo e Barroso, 1997). Vários membros da família Araceae são valorizados por suas folhagens ornamentais ou por suas inflorescências exóticas, destacando-se os gêneros Anthurium Schott, Philodendron Schott e Monstera Adans. Ocorrem naturalmente em locais quentes e úmidos, sombreados ou abertos, ou ainda como epífitas em florestas tropicais. Menos freqüentemente, observa-se também a existência de plantas rupículas, que crescem sobre rochas, como no caso de algumas espécies de Philodendron e Anthurium, ou ainda aquáticas, como o gênero Pistia L. (Joly, 1975; Heywood, 1993). O gênero destaca-se por sua significativa importância ecológica, diversidade de hábitos e pela presença em diferentes ecossistemas, bem como pelo potencial ornamental. O Brasil se sobressai como o país com o maior número de espécies, com relevância destacada na floresta Amazônica e na Mata Atlântica, embora espécies bem adaptadas estejam presentes também no cerrado e nos campos rupestres. O gênero Philodendron pertence à subfamília Philodendroideae, tribo Philodendreae (Mayo, 1990), sendo um dos mais importantes da família Araceae, não só pelo contingente populacional, mas também pela ampla utilização paisagística, devido à beleza de sua folhagem. Conta com aproximadamente 600 espécies já registradas (Mayo et al., 1997), distribuindo-se endemicamente nas Américas. Atualmente o gênero é dividido em três subgêneros: Philodendron, Pteromischum e Meconostigma, apresentando características morfológicas, anatômicas e biogeográficas próprias (Mayo, 1988). O surgimento de diversas espécies novas, encontradas em estudos de populações brasileiras (Nadruz, 1995), reflete a carência de novas pesquisas no sentido de melhorar o conhecimento da diversidade do gênero, elucidando também várias lacunas existentes em algumas regiões. Além disso, existe uma grande carência de estudos genéticos visando elucidar os processos evolutivos e adaptativos que regem os ecossistemas que envolvem a floresta Amazônica e o domínio da Mata Atlântica. Estudos moleculares têm sido pouco conduzidos na família Araceae, principalmente em gêneros neotropicais, como é o caso de Philodendron, devido ao baixo número de populações coletadas, carência de taxonomistas e também por dificuldades no isolamento de DNA genômico de 15

boa qualidade, especialmente devido à presença de compostos fenólicos e polissacarídeos contaminantes. O presente estudo visou caracterizar geneticamente espécies nativas do gênero Philodendron ocorrentes na Amazônia brasileira, incluindo populações da Amazônia Oriental (Floresta Nacional do Caxiuanã, Melgaço, PA), da Amazônia Central/Ocidental (Reserva Florestal Adolpho Ducke, Manaus, AM), como também da região Nordeste Brasileira (bioma Mata Atlântica) através da geração de marcadores dominantes do tipo DAF (DNA Amplification Fingerprinting). Comparações entre os dados obtidos e dados citogenéticos (números cromossômicos), bem como informações sobre as classificações propostas para as espécies analisadas são discutidas, visando fornecer subsídios para um melhor entendimento da diversidade e das relações infragenéricas deste importante gênero.

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2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Amazônia: Biodiversidade e Delimitação Geográfica

A Amazônia, localizada ao norte da América do Sul, ocupa uma área total de mais de 6,5 milhões de quilômetros quadrados, fazendo parte do território de nove países: Brasil, Venezuela, Colômbia, Peru, Bolívia, Equador, Suriname, Guiana e Guiana Francesa. Cerca de 85% da região, no entanto, fica em território brasileiro, onde ocupa mais de 5 milhões de quilômetros quadrados, aproximadamente 61% da área do país (Figura 1). Sua população, entretanto, corresponde a menos de 10% do total de habitantes do Brasil e sua densidade demográfica é detentora de 3,2 habitantes/km2. Só a Amazônia brasileira é sete vezes maior que a França e corresponde a 32 países da Europa Ocidental. A ilha de Marajó, que fica na embocadura do rio, é maior que alguns países como a Suíça, a Holanda ou a Bélgica. (Wikipédia, 2007). Em termos administrativos brasileiros, a região chamada Amazônia Legal (Figura 1) é composta dos seguintes estados: Acre, Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima, além de parte dos estados de Mato Grosso, Tocantins e Maranhão (Wikipédia, 2007).

Figura 1. Mapa ilustrando os Estados brasileiros que constituem a Amazônia Legal. Fonte: SIVAM.

Esta região possui mais de 200 espécies diferentes de árvores por hectare, possuindo também 1.400 tipos de peixes, 1.300 pássaros e 300 de mamíferos, totalizando mais de 2 milhões de espécies, a Amazônia representa um terço de toda a área de florestas tropicais do mundo, sendo essencial para o clima e a diversidade biológica do planeta (SIVAM, 2006). Trata-se da maior bacia de água doce do planeta, considerada uma das maiores riquezas do século XXI, devido ao aumento populacional e à escassez de fontes hídricas e minerais. Detém a maior fonte natural no mundo para produtos farmacêuticos e bioquímicos, sendo também detentora de 1/3 do total da área de florestas tropicais do planeta. 17

Contém ainda aproximadamente 30% da biodiversidade da Terra; dispondo de jazidas minerais de metais nobres dos mais variados tipos, acumulando recursos da ordem de US$ 1,6 trilhões. Destacam-se três tipos de vegetação na Amazônia Legal: (a) floresta ombrófila densa (floresta tropical pluvial); (b) disjunções da campinarana (campinas) e (c) uma disjunção da savana estépica (campo do alto do rio Surumu), área com intensa ação antrópica (SIVAM, 2006). A "mata de terra-firme", de acordo a imagens espaciais, possui um arquétipo heterogêneo relativo à sua florística e morfologia. Padrões de distribuição geográfica comum a várias espécies, definem províncias fitogeográficas distintas. Assim, existem grandes divergências entre a composição florística da Amazônia Oriental e Ocidental e, dentro de cada uma dessas áreas, entre o norte e o sul do divisor formado pelos rios Solimões e Amazonas (Ribeiro et al., 1999). Algumas áreas, como a região de Manaus, destacam-se por apresentar grande número de espécies endêmicas (Correia-da-Silva et al., 2007).

2.1.1. Reserva Florestal Adolpho Ducke A Reserva Florestal Ducke, formada por uma área de 100 km2 (10 x 10 km), pertence ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) desde 1963. No início da década de 50 foram feitas as primeiras coletas botânicas no local. Até 1972 a área foi destinada a experimentos silviculturais e foram executados plantios de espécies com importância econômica, ocupando menos de 2% da área total. Posteriormente, a área foi declarada Reserva Biológica, mantendo-se a cobertura vegetal intacta. Devido à proximidade com Manaus, a área constitui-se atualmente em uma das áreas da floresta amazônica mais próspera em estudos das mais diversas linhas. As pesquisas, no entanto, ficaram concentradas na porção noroeste da Reserva, numa área correspondente a 1/5 da área total (Ribeiro et al., 1999). A reserva leva o nome de um dos maiores defensores da região, o pesquisador Adolpho Ducke. Nasceu em Trieste em 1876. Em 1899 começou a trabalhar na Amazônia como entomólogo no Museu Emílio Goeldi, então Museu Paraense, empenhando-se posteriormente a pesquisar Botânica. Trabalhou principalmente na Amazônia, excursionando por todas as regiões. Publicou 180 artigos e monografias, dedicando-se principalmente ao estudo de Leguminosae. Descreveu 900 espécies e 50 gêneros. Permaneceu no Museu Paraense até 1918, colaborando com outras instituições como Jardim Botânico do Rio de Janeiro e Instituto Agronômico do Norte. Foi um dos maiores conhecedores da flora amazônica. Em 1954, no final da carreira, sugeriu ao INPA a criação 18

de uma Reserva, expressando sua preocupação com a preservação da floresta amazônica. Morreu em Fortaleza em 1959 (Lima, 2005).

2.1.1.1. Características Gerais

Atualmente a floresta da Reserva Ducke apresenta-se pouco alterada. Até 1991, as alterações na paisagem visíveis a partir de imagens de satélite, representavam apenas 5% da área total (figura 2). Com o decorrer dos anos a cidade chegou aos limites Sul e Oeste da Reserva, hoje adjacente ao bairro Cidade de Deus. Apenas no limite Leste a Reserva continua ligada à floresta contínua. Os principais problemas de extrativismo e invasão foram minimizados com a construção em 1994/95 de uma cerca nos limites Sul e Oeste e por uma fiscalização mais rígida. A caça é uma atividade bastante intensa e constitui um dos principais problemas (Ribeiro et al., 1999).

Figura 2. Foto satélite da Reserva Florestal Adolpho Ducke, localizada na periferia de Manaus, coordenadas 02º 53’ de latitude S e 59º 58’ de longitude W. Fonte: INPE (Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais).

A paisagem predominante na Reserva é do tipo colinosa. A altitude latitudinal entre os platôs originais e as áreas mais baixas é de aproximadamente 80 m. Os platôs são formados por solos argilosos de sedimentos mais antigos. Nos baixios, ocorrem solos arenosos e mais recentes, os quais seriam antigas praias e fundo de lagos, possivelmente remanescentes da época interglacial quando o Rio Negro estava a poucos metros acima do nível atual (Ribeiro et al., 1999). Atualmente a Reserva é destinada apenas para pesquisa e o acesso é controlado. Autorizações para visita ou atividades de pesquisa devem ser feitas junto a Coordenação de Suporte das Estações e Reservas do INPA, além dos órgãos fiscalizadores das esferas municipal, estadual e federal. A

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topografia do dossel no local da Reserva é suavemente saliente, com ondulações de mais ou menos 10 m de profundidade e que ocorrem a intervalos de aproximadamente 300 m. Cerca de 75% desta é coberta por floresta natural e o relevo no topo do dossel é sinuoso, devido ao crescimento diferencial da vegetação. Foram catalogados até o momento 12 gêneros pertencentes à família Araceae, os quais compreendem 55 espécies, no âmbito da Reserva (Ribeiro et al., 1999).

2.1.2. A Floresta Nacional do Caxiuanã e a Estação Científica Ferreira Penna

A Flona do Caxiuanã localiza-se no interflúvio entre o Tocantins e o Xingu, na Amazônia Oriental, no município de Melgaço (Pará), a oeste de Belém. Fica a 400 quilômetros da capital Belém. O levantamento mais recente indicou que a região abriga 29 famílias com 206 membros que sobrevivem da agricultura, pesca, coleta de castanha, extração de óleos naturais e produção de um rico artesanato com influência indígena (Lisboa e Ferraz, 1999). A Estação Científica Ferreira Penna possui uma base física de 3.000 m2 em 33.000 hectares da Floresta Nacional de Caxiuanã. Foi inaugurada em 1993, com a finalidade de apoiar programas de pesquisa de curto, médio e longo prazo, do Museu Goeldi e da comunidade científica nacional e internacional (Lisboa e Ferraz, 1999). De acordo com o Museu Goeldi, trata-se de uma área preservada, possuindo alguns dos ecossistemas naturais mais representativos da região amazônica, como a floresta de terra firme, igapó e várzea. Inúmeros projetos de pesquisa estão em desenvolvimento na estação, que também apóia teses de mestrado, doutorado, cursos de campo, seminários e visitas orientadas (Lisboa e Ferraz, 1999).

2.1.2.1. Características Gerais

Considerada como um dos ambientes naturais mais bem conservados, e com sua baixa densidade demográfica determinados pelo isolamento da criação da Floresta Nacional de Caxiuanã na década de 60, conjuntamente com uma alta biodiversidade local, resultaram na influência do Museu na escolha de Caxiuanã. Seus limites demográficos são, ao Norte, o divisor de água entre as bacias do rio Caxiuanã e do rio Amazonas, ao Sul, o rio Caxiuanã, a leste, a baia de Caxiuanã e o igarapé Laranjal e a Oeste o igarapé Grande. Seus rios são de águas negras, ricos em plantas aquáticas (Lisboa e Ferraz, 1999). 20

A floresta de terra firme é o ambiente mais extenso e diverso, ocupando cerca de 85% da área. Cresce sobre latossolos amarelos de origem terciária, com textura argilo-arenosa, ácidos, profundos e oligotróficos. Em estudos realizados recentemente na área, foi registrado que é o hábito arbóreo é quase completamente predominante sobre as demais formas da vida vegetal. A biomassa da floresta de terra firme é densa, com volume de madeira de acima de 200 m3/ha e a área basal maior que 20 m2 por hectare, quando se inclui somente árvores com DAP (diâmetro da altura do peito) com valores aproximados a 10 cm. Nas áreas de segmento secundário, a matéria orgânica agregada por unidade de área é positivamente relacionada ao tempo decorrido da sucessão (Lisboa e Ferraz, 1999). O sub-bosque da floresta de terra firme é sombreado com passagem de pouca luz direta, exceto nas frestas existentes entre copas e nas clareiras naturais formada por queda de árvores. Na vegetação secundária recente, o estrato inferior é bem iluminado. De acordo com Sioli (1951), a floresta de várzea localiza-se na bacia de Caxiuanã, contudo esta não é típica do estuário amazônico, pois as águas apresentam baixo teor de sedimentos. Entretanto, seu solo é hidromórfico com considerável teor de argila de aluvião, depositada em épocas anteriores, quando a baía de Caxiuanã detinha uma ligação com o canal norte do rio Amazonas. Nas florestas inundáveis, a várzea, que cresce sobre solos de aluvião quaternário ricos em nutrientes, apresenta biomassa vegetal maior quando comparada ao igapó (Lisboa e Ferraz, 1999). A floresta de igapó é relativamente baixa e de menor estrutura comparado à floresta de terra firme. Cresce sobre solos hidromóficos, também de origem terciária, ácida e pobre em nutrientes, devido principalmente à ausência de sedimentos nas águas escuras dos rios da bacia de Caxiuanã. A biomassa de igapó é inferior àquela registrada para as florestas de terra firme e várzea (Lisboa e Ferraz, 1999). A vegetação savanóide recorda a paisagem dos campos de Marajó, dominada pelo estrato herbáceo contínuo onde se destacam as gramíneas. Acredita-se que esta área seja relictual de leito de rio e baías, testemunhas da época quando os canais que drenavam do Amazonas ainda estavam em atividade. Seu solo, a exemplo da várzea e da paloevárzea, é hidromórfico e argiloso, de origem quartenária (Lisboa e Ferraz, 1999). Já a paleovárzea, apresenta uma vegetação mais alta do que na citada anteriormente, com solo hidromórfico. A misticidade da flora é grandiosa, contando com elementos de floresta de várzea e de terra firme. Atualmente sofre influência ínfima de inundação distando, em média, cerca de 300 m da margem da baía de Caxiuanã (Lisboa e Ferraz, 1999).

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2.2. Breve Histórico da Família Araceae

O nome Araceae vem de "arum", derivado diretamente do grego antigo "aron", que significa colheita ou produtos do campo. No que diz respeito às aráceas, este conceito pode estar relacionado às espécies comestíveis como "taioba" e "inhame". Registros macrofósseis mostram claramente que espécies pertencentes às Araceae já se apresentavam diferenciadas e com caracteres derivados desde o início do Terciário. Pelo menos dois gêneros atuais (Philodendron e Peltandra Rafin.) são reportados desde o Eoceno (Grayum, 1990). Outros seis gêneros (Pistia L., Arisaema Mart., Lysichiton Schott, Stenospermation Schott, Orontium L. e Calla L.) foram citados por Gregor e Bogner (1984), sendo conhecidos de uma época não específica do Terciário. Crepet (1978) sugeriu que as Araceae dispersaram-se provavelmente a partir do supercontinente Pangéia onde se encontravam bem estabelecidas, onde a seguir colonizaram os trópicos da Ásia e da África no final dos períodos Cretáceo ou Paleoceno. Embora apresente uma classificação sustentada, a família Araceae necessita de análises das mais diversas áreas das ciências botânicas, no que diz respeito à sua complexa organização em nível de populações e espécies. A maioria das aráceas desenvolve-se preferencialmente em lugares úmidos e sombreados. Incluem espécies terrestres eretas, rastejantes, trepadeiras e epífitas de florestas tropicais, variando de pequenos indivíduos a espécies de porte arbustivo (Mayo, et al., 1997). Nas regiões frias e secas, os espécimes tendem a ser tuberosos com dormência periódica, protegendo-se das temperaturas baixas. Em outras regiões de seca, perdem todas as partes aéreas durante vários meses do ano. Muitas dessas espécies crescem em florestas ou capoeiras, adaptando-se em áreas sombreadas e em abrigo de pedras, em paredões ou próximo à água. Diversas espécies podem ser aquáticas e semiaquáticas, sendo as últimas são reófitas (que vivem em água corrente ou brejo). O estado do Amazonas possui atualmente a maior diversidade de Araceae, com 20 gêneros e 120 espécies, onde 68 espécies são pertencentes ao gênero Philodendron, de acordo com Mayo, et al. (1995).

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2.2.1. Histórico do Gênero Philodendron

A história deste gênero inicia-se com a primeira descrição publicada, em 1829, apresentada de forma sucinta em um jornal austríaco, pouco conhecido, chamado: Wiener Zeitschrift für Kunst, Literatur, Theater und Mode (Mayo 1990a). Schott, em seu manuscrito, preocupou-se com a separação de dois novos gêneros de Araceae, Philodendron e Syngonium Schott, este último atualmente denominado Caladium Vent. (Coelho, 2000). Este novo conceito genérico de Schott destacou-se definitivamente como o mais importante avanço histórico na sistemática da família Araceae. Alguns anos depois, mais precisamente em 1832, Schott focou seu trabalho em um novo sistema da família publicado no Meletemata Botanica. Neste trabalho o autor apresentou conjuntamente o primeiro esquema infragenérico para o gênero Philodendron, fundamentando-se exclusivamente em caracteres florais, inserindo duas secções monoespecíficas (Meconostigma e Sphincterostigma), caracterizadas pela arquitetura do estigma. Posteriormente as duas seções foram agrupadas por Engler dentro do subgênero Meconostigma (Coelho, 2000). Somente 10 espécies de Philodendron foram representadas no manuscrito, tendo o autor publicado um trabalho mais completo 24 anos mais tarde (Schott, 1856 apud Coelho, 2000). Em 1837, o historiador e botânico austríaco Stephan Endlicher publicou um tratamento de Philodendron usando como base o grupo Meletemata de Schott (1856), divergindo apenas pela inclusão de uma descrição mais detalhada do gênero. Kunth, em 1841, publicou a primeira classificação do gênero que tratou das espécies separadamente. Seus taxa infragenéricos e seus caracteres diagnósticos permaneceram inalterados em relação ao tratamento dado a Meletemata por Schott. Embora ele tenha incluído espécies que foram mais tarde transferidas para o subgênero Pteromischum, o relato de Kunth foi preponderante para uma classificação minuciosa de espécies que posteriormente foram classificadas em seus respectivos subgêneros (Meconostigma, Philodendron e Pteromischum) (Coelho, 2000). A Synopsis Aroidearum compreendeu a primeira revisão completa de Schott (1856) em nível específico, trabalho que pretendia cobrir todo gênero, embora não tenha saído do primeiro volume. Na época, muito mais espécies de Philodendron dos trópicos do Novo Mundo foram descritas das coleções enviadas para a Europa. Em Synopsis foram descritas 99 espécies, número três vezes maior que o relatado por Kunth apud Coelho, 2000. A classificação final foi publicada no Prodromus Systematis Aroidearum (Schott, 1860), incluindo um inigualável arquivo de descrições e ilustrações (cerca de 4400 ilustrações a lápis e aquarela, incluindo 208 espécies de Philodendron) para diversos estudiosos, sendo útil até os dias atuais. As ilustrações coloridas foram feitas usando plantas

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cultivadas no Jardim Imperial do Palácio de Schönbrunn, Viena, estando entre as mais belas ilustrações botânicas conhecidas (Coelho, 2000). A primeira classificação de Engler do gênero Philodendron foi publicada em 1878, em um trabalho mais complexo de aráceas que foi escrito para a Flora Brasiliensis, onde o autor sumarizou o gênero juntamente ao relato sucinto das espécies brasileiras (Coelho, 2000). Entretanto, este autor descreveu poucas novas espécies em sua publicação, incluindo cerca de 86% das espécies previamente reconhecidas por Schott (1860 apud Coelho, 2000). Em 1879, Engler publicou um segundo manuscrito do gênero para o Prodromus de Alphonse de Candolle. Porém, esse tratamento apenas incluiu quatro espécies novas adicionais. Em sua terceira revisão publicada 20 anos mais tarde (Engler (1899 apud Coelho 2000)), o autor incluiu mais espécies novas, especialmente oriundas da Colômbia, Equador e América Central, onde exploração botânica estava mais ativa, resultando em um crescimento para 167 representantes (Coelho, 2000). Já em 1913, a revisão de Krause publicada na grande série de monografias de Engler intitulada Das Pflanzenreich, não alterou significativamente a classificação de Engler, embora tenha acrescentado espécies novas, totalizando 222. A importância de seu trabalho deveu-se à praticidade de suas ilustrações. A base da classificação se mantém desde o relato de Schott em, com cerca de 20 grupos de espécies conhecidos pela combinação de alguns poucos caracteres. Desde o trabalho de Krause, nenhum outro esforço foi feito para sumarizar dados sistematicamente dentro de uma nova classificação para o gênero. Entretanto, diversos estudos têm sido feitos e um elevado número de informações tem se acumulado desde aquela época. Novos levantamentos de espécies de muitos países neotropicais têm sido realizados, geralmente, no contexto de uma flora regional ou nacional (Coelho, 2000). Nas últimas décadas verificou-se um aumento expressivo do interesse pelo gênero. Mayo (1986b, 1988, 1989, 1990 e 1991) realizou um detalhado estudo da anatomia da inflorescência, corroborando a delimitação do subgênero Meconostigma e confirmando o subgênero Philodendron como um táxon bem definido e propondo uma nova nomenclatura infragenérica para o gênero. Grayum e Croat (Jardim Botânico do Missouri) avaliaram alguns subgêneros de Philodendron, tendo o primeiro autor trabalhado com o subgênero Pteromischum enquanto o segundo tratou das espécies da América Central (Mayo, 1990). Uma das mais importantes contribuições para a delimitação atual do gênero foi dada por G.S. Bunting (1975, 1980, 1984, 1986, 1987 e 1988), refletindo seu interesse especial em Philodendron por mais de 20 anos. Seu trabalho envolveu muitos aspectos, incluindo nomenclatura, cultivo, anatomia vegetativa, bem como taxonomia. Novos dados têm sido levantados sobre diversos 24

aspectos da biologia de Philodendron em áreas como botânica, sistemática e evolução (Mayo, 1986b).

2.3. Taxonomia e Botânica da família Araceae

Desde 1920, com a obra de Engler e Krause, que vem ocorrendo modificações de nomenclatura das subfamílias de Araceae. Os recentes trabalhos como o de Grayum (1990), inserem Monsteroideae em Pothoideae, Philodendroideae em Calloideae, Pistioideae em Aroideae e conservam Lasioideae e Colocasioideae. Baseados em caracteres morfo-anatômicos French et al. (1995) e Mayo (1997) incluíram Colocasioideae e Philodendroideae em subfamílias distintas, juntamente com outras sete: Gymnostachydoideae, Orontioideae, Pothoideae, Monsteroideae, Lasioideae, Calloideae e Aroideae. Um dos recentes trabalhos compilados de dados anatômicos foi de Keating (2004), o qual propôs uma recente classificação para a família, decrescendo uma nova subfamília: Schismatoglottidoideae e mantendo Gymnostachydoideae, Orontioideae, Pothoideae, Lasioideae, Calloideae, Philodendroideae, Lemnoideae e Aroideae como subfamílias distintas. A maior diversidade do gênero Philodendron foi observada na região amazônica, a noroeste da América do Sul, incluindo parte do Brasil, Colômbia, Venezuela e Equador (Mayo, 1989). O gênero é importante pela sua presença em uma ampla diversidade de habitats, ocorrendo principalmente em florestas tropicais úmidas, brejos e afloramentos rochosos, embora cresça também em regiões semi-áridas (Mayo, 1988). As Araceae apresentam características peculiares no que tange à sua inflorescência, especialmente na espádice, associada a uma bráctea, como também a espata, flores pequenas, actinomorfas, sem bractéolas, gineceu, gamocarpelar, fruto baga e uma outra característica marcante na família de taninos, presentes nas suas vistosas folhas (Grayum, 1990). Existem diversas espécies de Philodendron com hábito epifítico, adaptação que se deve principalmente à presença de raízes adventícias, que servem de fixação ao substrato, geralmente árvores. Várias espécies desenvolvem ainda raízes pendentes que atingem o chão, os chamados “cipós”. De acordo com Madison (1977) e Mayo (1986b), o hábito mais freqüente do gênero é o hemiepifitismo lianescente. As espécies do subgênero Pteromischum são quase que exclusivamente hemiepífitas lianescentes, ou seja, embora a planta germine no solo, o caule irá se desenvolver sobre troncos de árvores fixando-se por meio de raízes adventícias, como ocorre em P. platypodum e P. surinamense. A despeito da prevalência de hemiepífitas, observa-se no subgênero Philodendron uma ampla variação de hábitos, incluindo além de hemiepífitas, também plantas terrestres e terrestres 25

rizomatosas, embora existam espécies epífitas verdadeiras, que crescem em árvores, sem nenhum contato com o solo, como no caso de P. insigne, P. melinonii e P. pulchrum. No subgênero Meconostigma, muitas espécies apresentam hábito arborescente, como P. goeldi. Entretanto observa-se um caráter hemiepífitico primário, que de acordo com Putz & Holbook (1986 apud Croat, 1994), consistem em plantas que germinam em árvores sem o contato primário com o solo, mas quando chegam à fase adulta são ligadas ao solo por meio de raízes alimentadoras. Exemplos de representantes que possuem este tipo de raiz incluem P. billietiae, P. hylaeae, P. megalophyllum e P. goeldi, sendo esta última bastante distinta das demais por possuir lenticelas, característica imprescindível para a detecção do indivíduo no campo através das raízes, pois a planta habita as copas de grandes árvores (Soares, 1996). A família também apresenta uma grande diversidade fenotípica e heteroblastia (diferença das fases de desenvolvimento incidindo na morfologia caulinar e foliar), ou seja, plantas jovens podem originar folhas com formas diferentes das encontradas na fase adulta (Croat, 1988). As inflorescências dos membros de Philodendron Schott apresentam pedúnculo relativamente curto, espádice com inflorescência monóica, possuindo flores femininas na porção basal e masculina férteis na porção superior, em diversas espécies separadas por uma zona de flores masculinas estéreis (Mayo, 1991). Na porção apical das flores masculinas observam-se flores estaminadas, as quais se intercalam entre flores estéreis, portadoras de estaminódios, formando uma zona masculina estéril intermediária, embora uma zona estéril apical, formada por flores estéreis no ápice da espádice também possa ser observada (Soares, 1996). A espata é um órgão atrativo especializado, que protege o desenvolvimento das flores da espádice, desempenhando um importante papel na biologia da polinização. O entrenó entre a espata e a espádice (estípite da espádice) é geralmente muito curto ou ausente, enquanto o pedúnculo – o entrenó entre a espata e a última folha do ramo ou catafilo – é muito maior. A inflorescência ainda inclui uma grande variação de odores encontrados em diferentes gêneros, padrões de cores, especialmente na espata, observando-se uma relativa persistência (de regiões diferentes) da espata (Mayo, et al., 1997; Bown, 2000). Pohl (1932b apud Mayo, et al., 1997) e Mayo (1986a e 1989), realizaram estudos no gênero Philodendron, os quais evidenciaram a existência de adaptações do tecido da espata, secreção de resina através de vários tipos de canais na espata e na espádice, bem como, uma larga variação na estrutura do androceu e gineceu. Na formação dos frutos, a espata fecha firmemente em torno das flores e fica intacta para protegê-los até seu amadurecimento. Os frutos são do tipo baga com uma a muitas sementes. As 26

bagas são coloridas (creme, vermelho ou laranja), exceto em P. goeldi que apresenta bagas brancas. Sementes no subgênero Meconostigma às vezes possuem sarcotesta ou funículo arilado ou ambos. As sementes de Philodendron destacam-se por serem as menores da família sugerindo-se que possam aderir-se em seus dispersores (Bown, 1988). Quando completamente formadas, as sementes muitas vezes apresentam-se envolvidas por uma polpa mucilaginosa, indicando que a planta estaria próxima do seu ciclo de dispersão. Muitos pássaros são atraídos pelas cores vibrantes das flores e frutos, não só em Philodendron, mas também em outros gêneros da família Araceae (Mayo, 1997). Muitas espécies de Philodendron possuem fragrâncias que exalam aromas associados aos hábitos dos polinizadores, em geral besouros pertencentes às famílias Rutelinae e Dynastinae. Diferentes insetos podem visitá-las, o que nem sempre implica em polinização (Coelho, 2000). Geralmente a polinização ocorre em duas noites subseqüentes. Na primeira a espata desabrocha e as flores femininas são expostas. A espata fecha levemente após a primeira noite, mas não o bastante para prender completamente os insetos. Entretanto, dezenas de besouros podem ser encontrados no tubo da espata após a primeira noite de sua abertura. Já na segunda noite, a fragrância e o calor são produzidos novamente, quando o pólen é liberado. Nesse estágio os estigmas não estão mais receptivos, levando à polinização preferencialmente cruzada. Logo após a liberação do pólen na segunda noite, os besouros são atraídos por fragrâncias que são exaladas através de um aumento de temperatura provocado pela oxidação de lipídios (Mayo, 1991), atraindo-os para a região superior da inflorescência, coincidindo com o processo de fechamento da espata que ocorre antes da saída dos besouros para novas visitas.

2.3.1. Taxonomia e Botânica de Philodendron

O gênero Philodendron é o segundo maior gênero da família Araceae, estimando-se que inclua de 350 (Bunting, 1986; Mayo, 1986) até 400 espécies (Coelho, 2000). Apresenta uma área de distribuição essencialmente neotropical, atingindo o seu limite meridional na região do Rio la Plata. Distribui-se em três subgêneros: Meconostigma, Pteromischum e Philodendron. O subgênero Meconostigma inclui cerca de 15 espécies, muitas delas presentes no Brasil, as quais são adaptadas a ambientes abertos. A característica principal do subgênero é a presença de uma zona estéril na espádice (Mayo, 1986b). O subgênero Pteromischum, compreende cerca de 75 espécies, ocorrendo desde o México até o noroeste da América do Sul, caracterizando-se pela morfologia do caule (composto de unidades simpodiais com muitas folhas), lâmina foliar simples e bainha foliar comprida. Já o subgênero Philodendron, detentor de 10 seções e 11 subseções compreende o maior 27

número de espécies do gênero. Ao contrário de Pteromischum, a morfologia do caule é composta por unidades simpodiais de uma única folha e de uma inflorescência com uma zona estéril, entre as zonas masculina e feminina, que é mais curta do que a zona masculina. Estes dois últimos subgêneros apresentam geralmente hábito epifítico e hemiepifítico (Coelho, 2000). Membros do subgênero Philodendron, além dos hábitos anteriormente descritos, podem ser também terrestres ou até rizomatosos, embora predominem as hemiepífitas (Mayo, 1986b). Este subgênero possui ramos flageliformes, que deslocam o meristema no espaço buscando melhores condições para o seu desenvolvimento (Blanc, 1980; Coelho, 2000), crescendo verticalmente sobre o tronco da hospedeira, como por exemplo, em P. linnaei e P. fragrantissimum, ou crescendo lateralmente, como no caso da P. platypodum. Espécies do gênero possuem em geral, folhas numerosas, pequenas a gigantes, profilos de caules maduros marcescentes e decíduos ou persistentes e membranáceos ou decompostos até uma rede fibrosa. Pecíolo geralmente verrucoso ou coberto com protuberâncias do tipo escamas, às vezes geniculado no ápice; bainha longa com lígula curta em folhas monopodiais de todos os subgêneros e em folhas simpodiais no subgênero Pteromischum, entretanto nos subgêneros Philodendron e Meconostigma a bainha é muito curta e quase imperceptível. As inflorescências apresentam pedúnculo geralmente mais curto que o pecíolo, cilíndrico ou subcilíndrico. Espata ereta, persistente, decídua após o amadurecimento dos frutos (raramente após a antese), geralmente grossa e constrita entre tubo e lâmina; tubo ventricoso, frequentemente de coloração internamente púrpura ou vermelha; lâmina com parcial ou completa abertura na antese; espádice séssil e estipitada, denominada zona feminina, geralmente mais curta que a zona masculina fértil, constituída por estames férteis, localizada no ápice da espádice e separada por uma zona estéril intermediária, composta de estaminódios e em geral mais curta do que a zona masculina fértil. As flores são unissexuais e nuas com flores masculinas apresentando dois a seis estames, prismáticos a obpiramidais, raramente alongados e finos (subg. Meconostigma), anteras sésseis a subsésseis, teça elipsóide à oblonga, alongada, deiscência por curta fenda lateral ou por poro subapical. A flor feminina é composta de apenas um gineceu ovóide, subcilíndrico, cilíndrico, ou obovóide, ovário com dois a 47 lóculos, óvulos com um a 50 por lóculo, geralmente hemianátropos, funículo com ou sem tricomas. O estilete é tão largo quanto o ovário, às vezes lobado, estigma discóide, globoso, às vezes lobado. Fruto com uma baga, subcilíndrica a obovóide, geralmente vermelha, amarela, branca ou vermelho-alaranjada. Sementes numerosas, variando muito em tamanho e endosperma abundante (Soares, 1996; Coelho, 2000; Temponi et al., 2005). Alguns estudos têm sido realizados no intuito de classificar detalhadamente o gênero Philodendron, principalmente investigando aspectos morfológicos. Mayo (1986, 1986b, 1988, 1989, 28

1990, 1991, 1995, 1997) foi um dos maiores investigadores do grupo (e da família), conseguindo elucidar diversos questionamentos, contribuindo para um melhor entendimento de Philodendron e de outros gêneros. No Brasil destacam-se trabalhos como o de Soares (1996) que estudou taxonomicamente espécies ocorrentes no estado do Amazonas através de caracteres morfo-anatômicos, encontrando oito seções com 26 espécies distribuídas nos três subgêneros. Em outro estudo Coelho (2000) analisou morfologicamente espécies do gênero ocorrentes na Reserva Ecológica de Macaé de Cima, classificando-as em dois subgêneros (Philodendron e Pteromischum), encontrando cinco novas espécies na região, adicionadas a outras cinco espécies anteriormente reportadas. Também merece menção o trabalho de Sakuragui (2001), que estudou a seção Calostigma ocorrente no Brasil, definindo padrões de distribuição geográfica associados a aspectos morfológicos do grupo estudado, estabelecendo espécies de distribuição ampla ou restrita, bem como plantas endêmicas de algumas regiões brasileiras.

2.4. Importância Econômica

A família Araceae possui diversos aspectos que fazem com que seja muito importante economicamente. O inhame (espécie Colocasia esculenta (L.) Schott.), usado como matéria prima na alimentação humana, é muito consumido em regiões tropicais do mundo todo, tratando-se da espécie de maior importância econômica no grupo. Outro tubérculo muito consumido na Ásia, o taro, inclui cultivares e híbridos de diferentes Colocasia Schott e Alocasia, tratando-se da principal Araceae submetida a programas de melhoramento para cultivo em larga escala (Ochiai et al.,1997). O gênero neotropical Xanthosoma também contém espécies comestíveis importantes, sendo amplamente cultivadas devido às suas folhas e tubérculos ricos em amido, normalmente consumidos após o cozimento (Mayo et al., 1997; Bown, 2000). O “inhame-gigante” (Alocasia sp.) foi amplamente usado na alimentação animal no século 19, apresentando, porém, pouco uso como fonte de alimentação humana. Os tubérculos ricos em amido do “inhame-de-elefante” (Amorphophallus sp.) são comumente usados como alimento na Ásia Tropical, especialmente na Índia, onde a espécie é amplamente cultivada. No México as infrutescências maduras e frescas de “costela-de-adão” (Monstera deliciosa Liebm.) são consumidas e usadas para aromatizar sorvetes, apresentando um sabor que lembra o de abacaxi. As sementes de espécies dos gêneros Typhonodorum e Montrichardia são registradas como alimentos dos nativos de

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Madagascar e da América do Sul Tropical, respectivamente, depois de cozidas ou tostadas (Mayo et al., 1997; Bown, 2000). Como ornamentais destacam-se também os gêneros Caladium, Dieffenbachia, Monstera, Spathiphyllum Schott & Endl. e Syngonium, ocorrendo naturalmente em locais quentes e úmidos, sombreados ou abertos, ou ainda como epífitas em florestas tropicais (Joly, 1975; Heywood, 1993). Espécies do gênero Philodendron têm sido tradicionalmente utilizadas para fins ornamentais, principalmente porque apresentam folhagens vistosas e por serem capazes de resistir a baixos níveis de luminosidade, proporcionando vários usos em paisagismo. Algumas espécies de Philodendron têm uso medicinal, como é o caso da P. ochrostemon, usada no tratamento de bronquite crônica e aguda, aplicada como pasta medicamentosa ou em banhos diários com a água do cozimento das folhas. A decocção também é usada como uma compressa para edemas, articulações reumáticas e úlceras. A seiva espremida das folhas serve como um lubrificante. Já a espécie P. imbe Schott, ocorrente na Amazônia, é muito utilizada para tratamentos reumáticos (Plowman, 1969), como também úlceras. Croat (1994) cita algumas outras espécies usadas na medicina popular, como P. cuneatum (Engl., 1885), usada pelos índios Taiwano do Rio Kananarí (Colômbia) como antiinflamatório da pele, bem como P. fragrantissimum (W.J. Hook) G. Don e P. pedatum (Hook.) Kunth. Os índios Kubeo (Colômbia) utilizam a espata de P. insigne Schott em rituais amorosos (Schultes & Raffauf - apud Croat, 1994). A espécie P. hylaeae Bunting foi reportada pelo seu uso nos tratamentos de combate a vermes, triturando as folhas e pecíolos, que são adicionadas à farinha de mandioca. Já P. megalophyllum Schott, usualmente chamadas pelos índios Waorani da Guiana Francesa pelo nome de “co-me”, é usada como antídoto contra picadas de cobra (Soares, 1996). Muitos gêneros da família Araceae possuem um grau de toxicidade elevado que pode causar irritabilidade quando em contato com o ser humano. O próprio inhame possui uma irritante toxina que pode irritar a pele, caso não seja cozido. Por serem conhecidas como plantas perigosas, certas espécies são cultivadas por populações tradicionais com o intuito de espantar forças negativas (Lisboa e Ferraz, 1999). O gênero Philodendron também apresenta algumas espécies bastante nocivas, as quais são causadoras de dermatites, como é o caso de P. scandens K. Koch & Sello, P. angustisectum Engl., P. erubescens C. Cock & Augustin e P. radiatum Schott (Reffstrup et al., 1982; Reffstrup & Boll, 1985). Um exame mais acurado de compostos de Araceae foi publicado por Williams, et al. (1981), que investigaram proantocinidinas, ácido cinâmico, antocianinas e flavonóides de Araceae. De

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acordo com a análise, procianidinas ocorrem em níveis proporcionais nos taxa investigados enquanto C-glicoflavonas são flavonóides característicos presentes em folhas da família como um todo.

2.5. Marcadores Moleculares em Vegetais

O advento de técnicas bioquímicas e moleculares, baseadas na análise de polimorfismos de enzimas e mais tarde de fragmentos de DNA, permitiram, em um curto período de tempo, a disseminação do uso de marcadores moleculares no estudo dos aspectos básicos de genética vegetal. A utilização destas informações moleculares na análise de diversidade genética e de relacionamentos filogenéticos com acessos não domesticados de germoplasma tem o potencial de facilitar o monitoramento e a ampliação da base da genética de populações (Milach et al., 1998). Marcadores moleculares são características de macromoléculas que diferenciam dois ou mais indivíduos ou táxons. Tratam-se de moléculas como DNA ou proteínas que podem representar uma região ou regiões do genoma ligadas a alguma característica incluindo-se aquelas de interesse agronômico. Características morfológicas e agronômicas têm a desvantagem de serem influenciadas por fatores ambientais, podendo não representar a real similaridade ou diferença entre os indivíduos. Por outro lado, marcadores genéticos representam estritamente a variação genética, não sofrendo influência ambiental (Weising et al., 2004). Adicionalmente, o desenvolvimento de tecnologias de marcadores de DNA representou um grande avanço quando comparado à análise isoenzimática, uma vez que acessa características genéticas informativas do ponto de vista evolutivo, sem influência de mecanismos fisiológicos ou do meio ambiente, gerando um número quase ilimitado de polimorfismos (Benko-Iseppon, 2001). Do ponto de vista da genética conservativa, dependendo do tipo de marcador molecular utilizado, podem-se observar taxas de evolução e/ou substituição diferentes, de modo que, usando análises criteriosas para a escolha do marcador, pode-se elucidar questões relativas à identificação de espécies ou formulação de hipóteses filogenéticas em grupos supra-específicos (Solé-Cava, 2001). Entre os marcadores mais usados figura o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) que usa iniciadores (primers) curtos, em geral decâmeros, sendo amplamente usados para diversas aplicações. Já as técnicas de DAF (DNA Amplification Fingerprinting) e STMS (Sequence Tagged Microsatellite Site), também amplamente usadas em espécies vegetais, mostraram-se como marcadores altamente eficientes na geração de polimorfismos em grão de bico (Cicer arietinum), apesar da estreita base genética desta cultura (Winter et al., 2000). 31

Caetano-Anollés et al. (1991a,b) desenvolveram o método DAF utilizando primers de 5 a 15 nucleotídeos, sendo que o comprimento ótimo encontrado foi de oito nucleotídeos, tamanho este que gerou resultados que superaram a eficiência do RAPD, onde os polimorfismos não foram reprodutíveis com este mesmo número de bases. Esta metodologia tem sido empregada em diversas culturas vegetais, sendo considerada uma poderosa ferramenta na identificação individual, avaliação do grau de parentesco entre indivíduos, estudo da variabilidade genética e na construção de mapas de ligação (Caetano-Anollés et al., 1991). Em 1993, o citado autor e seus colaboradores obtiveram, por exemplo, informações eficientes de amplificações geradas usando primers com apenas cinco bases (5-meros) em soja. Esta técnica destaca-se como vantajosa sobre o método de RAPD, uma vez que gera um grande número de bandas polimórficas com boa reprodutibilidade, independentemente do tamanho dos primers (Benko-Iseppon et al., 2003). A técnica de DAF tem sido usada em diversos organismos, como em Crawford (2006) que a aplicou para identificar o gene MCF-7 no cromossomo 12, presente em linhagens de células epiteliais mamárias humanas normais e ausente em linhagens de células cancerosas humanas, identificando a ocorrência de uma deleção em células neoplásicas. Já em microorganismos, o DAF tem sido usado também como uma metodologia eficiente para geração de polimorfismos para análises de filogenia molecular (Babalola, 2003). Em fungos Baird et al. (2006) obtiveram um melhor resultado quando os âmplicons de DAF foram submetidos a uma reamplificação pelo método de ASAP (Arbitrary Signatures from Amplification Profiles), uma vez que os produtos gerados inicialmente não conseguiam diferenciar uma espécie da outra, o que foi solucionado com a reamplificação. Estas técnicas moleculares têm sido bastante utilizadas em plantas cultivadas; no entanto, existe uma grande carência no que tange às plantas nativas, devido aos altos custos, dificuldade de acesso ao material, bem como a dificuldade de estocagem do mesmo até o momento da análise ex situ. Existem, porém, alguns trabalhos com espécies nativas. Por exemplo, Pereira et al. (2004) avaliaram os efeitos da adaptação de plantas arbóreas do cerrado a uma condição de estresse, resultante da presença de metais tóxicos no solo através da metodologia de RAPD. Os pesquisadores observaram uma menor diversidade nas populações em ambientes estressantes comparativamente àquelas ocorrentes em situações ambientais normais, sugerindo um possível efeito fundador associado à deriva genética. Por outro lado, sugeriu-se que semelhanças entre os grupos de populações remontariam a uma ainda existente ligação entre os grupos através de fluxo gênico. Oliveira et al. (2007), caracterizaram a diversidade genética em 116 acessos nativos e cultivados de Açaí (Euterpe oleracea Mart.) usando RAPD, revelando ampla diversidade entre os 32

acessos, uma vez que o número de polimorfismos foi elevado (263). A análise revelou distinção de alguns acessos da mesma população, sugerindo assim a decorrência de cruzamentos aparentados ou autofecundações (Souza, 2002), ressaltando a forte redução de tamanhos de açaizeiros devido à exploração de palmito e à devastação de milhares de indivíduos da espécie em estudo.

2.5.1. Análise de Marcadores e Geração de Dendrogramas

Apesar dos vários métodos de análise, dos perfis de polimorfismos e sua conversão em fenogramas, a metodologia de UPGMA (Unweighted Paired Group Method Aritmhmetic Average) tem sido uma dos mais utilizadas em plantas cultivadas (Alcochete, 2005). Diversos métodos têm sido aplicados para analisar dados com RAPD e DAF, usando-se os coeficientes de Nei e Li (1979), de Jaccard (1908) ou ainda de Simple Match (Duarte et al., 1999; Kosman e Leonard, 2005). Adicionalmente, os métodos de agrupamento mais conhecidos na literatura para matrizes de distância tem sido UPGMA de Sneath e Sokal (1973) e Neighbor-joining (NJ) de Saitou e Nei (1987). Embora esses métodos sejam projetados para produzir árvores únicas (Nei, 1987; Saitou e Nei, 1987), os mesmos podem às vezes derivar mais de uma forma para os mesmos dados, o que depende muito da maneira (ordem) como são incorporados na planilha (Bayer, 1985; Kovach, 1993). A partir de unidades taxonômicas operacionais (OTU’s), podem ser construídos fenogramas. Entretanto este método também é utilizado para construção de árvores filogenéticas, desde que as taxas de evolução sejam constantes entre diferentes linhagens (distância relativamente linear entre a distância evolutiva e o tempo de divergência) (Bayer, 1985). Embora existam muitos programas disponíveis para realizar análises filogenéticas ou de relação genética entre graus de proximidade, alguns softwares são mais aplicados a depender do tipo de dados alimentados. Tanto o NTSYS (Rohlf, 1997), quanto o PHYLIP (Felsentein, 2003) como o MEGA 4 (Sudhir et al., 2007), podem ser utilizados para os fins citados. Este último (MEGA, Molecular Evolucionary Genetics Analysis) permite inferências filogenéticas e fenéticas, bem como estudos de padrão de duplicação de genes dentro de famílias multigênicas. O MEGA contém duas análises de reconstrução filogenética, distância-base e máxima parcimônia (MP). Além disso, inclui também os métodos UPGMA, NJ e Minima Evolução (ME), os quais servem para inferir sobre filogenias utilizando matrizes de distâncias (Sudhir et al., 2007).

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2.6. Marcadores Moleculares em Araceae

Ainda são restritos os trabalhos realizados com angiospermas nativas do Brasil incluindo a aplicação de metodologias moleculares, com a maioria dos estudos restritos a espécies cultivadas ou de interesse econômico (Benko-Iseppon, 2001). Em se tratando das Araceae, a maioria das análises incluindo caracteres moleculares referemse a padrões de restrição de DNA de cloroplasto ou ao seqüenciamento de segmentos rbcL desta organela. Estas abordagens são muito úteis para estudos macrotaxonômicos, porém nem sempre são informativas em nível intergenérico, sendo por vezes pouco informativas em nível interespecífico e interpopulacional, devido à alta conservação das seqüências de cloroplasto que apresentam herança materna e não sofrem recombinação (Hillis et al.,1996). Uma análise cladística usando seqüenciamento de segmentos rbcL foi feita em Ariflorae por French et al. (1995) situando o gênero Anubias Schott como um grupo irmão de Homalomena, Furtadoa M. Hotta e Philodendron, enquanto Montrichardia emergiu como um grupo-irmão destes quatro gêneros. Estes resultados levaram Grayum (1996) a sugerir que as Homalomeninae constituiriam um grupo parafilético. Metodologias como RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) têm sido usadas em estudos moleculares para fins de melhoramento, comparando espécies nativas e cultivares do gênero Colocasia e Alocasia, para aplicação no prémelhoramento visando incrementos na produção de tubérculos no Japão e na China (Ochiai et al.,1997; 2000; 2001). Loh et al. (2000) analisaram por meio de AFLP a diferenciação de espécies de Caladium (C. humboldii e C. lindenii), como também a diversidade genética entre os gêneros Caladium, Hapaline, Alocasia e Protarum. De acordo com tratamentos morfológicos, a espécie C. humboldii possui padrões cromossômicos de C. bicolor, entretanto, as análises moleculares feitas pelos pesquisadores evidenciaram que existe grande divergência interespecífica, bem como a inexistência de transferência horizontal entre as espécies. Por outro lado, o estudo intergenérico corroborou dados de estudos anteriormente realizados (French et al., 1995; Mayo et al., 1997), onde as tribos Caladieae e Colocasieae foram agrupadas em táxons distintos. Buldewo e Jaueerally-Fakim (2002) procederam ao isolamento e limpeza de DNA da espécie A. andreanum, com o intuito de melhorar a qualidade do DNA para utilização em amplificações por PCR, incluindo RAPD, AFLP e Microssatélites, com amostras livres de contaminantes comuns em extrações de Araceae, como polissacarídeos e polifenóis. Foram testados três protocolos, porém, o DNA de melhor qualidade foi obtido a partir do tecido da espata, superior quando comparado às 34

extrações a partir de folhas. Os autores chegaram à conclusão que o tecido da espata apresenta menor quantidade de contaminantes, principalmente quando comparado aos resultados de quantificação e qualificação em gel de agarose, podendo-se observar arrastes de degradação de DNA de folha, possivelmente provocados pela ação de compostos secundários, presentes em grandes quantidades, e precipitados juntamente com o DNA genômico durante os procedimentos de isolamento. Tam (2002) pesquisando a subfamília Monsteroideae, composta de quatro tribos (Spathiphylleae Engl., Anadendreae Bogner & French., Heteropsideae Engl. e Monstereae Engl.), utilizando o marcador AFLP, observou que os gêneros de Monstereae, de Heteropsideae e de Anadendreae formaram um grupo monofilético. Estudos preliminares feitos pelo pesquisador demonstraram uma incapacidade de distinguir a taxonomia das Monsteroideae, especialmente na tribo Monstereae. O mesmo ressaltou que não foi possível indicar uma filogenia confiável para o grupo ou compreender totalmente as relações intergenéricas devido à insuficiência dos dados. Tam et al. (2004) realizaram um estudo sobre a filogenia intergenérica e infrafamiliar da subfamília Monsteroideae com auxílio de seqüências de trnL-F de cloroplastos. O objetivo da pesquisa foi esclarecer várias questões sobre as relações filogenéticas entre as espécies estudadas até então não estabelecidas. O trabalho ressaltou direcionamentos filogenéticos feitos a partir da subfamília, utilizando um agrupamento de grupos externos, como Rhaphindofora. A partir das análises dos clados mostrados pela árvore do trnL-F, as subfamílias Gymnostachydoideae e Orontioideae devem ser tratadas como uma única subfamília, tal como em Pothoideae e Monsteroideae, como sugerido por Grayum (1990) e French et al. (1995). Algumas questões precisam ser averiguadas, como o relacionamento de alguns grupos estabelecidos nesse estudo, embora o ordenamento preliminar da tribo corrobore a abordagem dos taxonomistas. Woloszynska et al. (2004) sugeriram que ocorreu transferência horizontal do gene trnA de cloroplasto de uma monocotiledânea para a mitocôndria de um ancestral de Phaseolus vulgaris L., evidenciando neste trabalho uma similaridade entre a seqüência desta espécie e a de P. scandens. Chen et al. (2004), realizaram a primeira investigação molecular para identificar a relação genética entre espécies e cultivares do gênero Aglaonema Schott (Araceae) usando o marcador AFLP. Foram utilizadas 60 amostras de Aglaonema, sendo 54 cultivares, uma duplicata de A. communtatum e cinco outros gêneros de Araceae. Os resultados revelaram grupos geneticamente similares, mostrando-se úteis na identificação de germoplasma do gênero, para fins de conservação e desenvolvimento de novas cultivares. Nowbuth et al. (2005) analisaram a variação genética entre 24 cultivares de Anthurium através da técnica de RAPD, identificando um baixo nível de variabilidade genética, sugerindo a 35

ocorrência de erosão genética entre os acessos analisados devido a sucessivos cruzamentos para geração de variedades comercialmente melhoradas. Embora que essa baixa variabilidade seja limitante, os autores destacaram que a mesma seria crucial para o sucesso da produção de flores ornamentais usando genótipos deste gênero. Nie et al. (2006), analisaram a subfamília Orontioideae através de seqüências de cloroplastos (trnL-F e ndh-F), no intuito de reconhecer padrões evolutivos e estimar o tempo de divergência entre linhagens selecionadas do hemisfério norte. A subfamília foi considerada monofilética, corroborando estudos anteriormente realizados (Mayo et al., 1997). Utilizando métodos Bayesianos, os pesquisadores estimaram, por exemplo, que o gênero Orontium divergiu entre 30 e 40 milhões de anos do complexo Symplocarpus-Lysichiton. Gonçalves et al. (2007), reconstruíram a filogenia da tribo Sparthicapeae baseando-se em dados moleculares de cloroplastos (matK e ndh-F) e morfológicos (histo-anatômicos), com o objetivo de avaliar a taxonomia do grupo e descrever sua história biogeográfica na América do Sul. Os resultados comprovaram que Dieffenbachia e Bognera pertencem à tribo citada, confirmando estudos anteriores que indicavam sua condição monofilética, como os realizados com cloroplastos (French et al., 1995) e com análises de morfologia cromossômica (Mayo et al., 1995). No entanto, os autores discordaram da proposta de Mayo et al. (1997) de que os gêneros citados fossem separados em duas tribos (Dieffenbachieae e Spathicarpeae). A tribo Sparthicapeae distribui-se em regiões com períodos de secas da América do Sul, tais como o Chaco (Paraguai e Argentina) e a caatinga Brasileira (Nordeste do Brasil). Os resultados de Gonçalves et al. (2007) indicaram dois eventos de colonização da tribo nas Cordilheiras dos Andes, propondo-se que inicialmente a evolução da tribo se deu neste local, povoando posteriormente o centro andino, da Argentina ao Peru e dispersando-se posteriormente em direção ao Brasil, chegando à Mata Atlântica. O surgimento da tribo na floresta Amazônica teria ocorrido pela diversificação de Dieffenbachia, gênero detentor da maior diversidade de espécies na região (Croat, 2004), com D. humillis sendo considerada a espécie mais basal (Gonçalves et al., 2007).

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3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO

44

Manuscrito de Artigo

Diversidade e relações genéticas em espécies brasileiras de Philodendron (Araceae) reveladas por DAF (DNA Amplification Fingerprinting) Genetic Diversity and relationships in Brazilian Philodendron (Araceae) species revealed by DAF (DNA Amplification Fingerprinting)

A ser submetido ao Botanical Journal of the Linnean Society 45

Título

Diversidade e relações genéticas em espécies brasileiras de Philodendron (Araceae) reveladas por DAF (DNA Amplification Fingerprinting)

Autores

ISAAC FARIAS CANSANÇÃO1, MARIO CORREIA DA SILVA1, MARIA DE LOURDES DA COSTA SOARES2 E ANA MARIA BENKO-ISEPPON1

1

Universidade Federal de Pernambuco, Laboratório de Genética Vegetal e Biotecnologia,

Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Recife, Pernambuco, Brasil.

2

INPA - Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, Departamento de Botânica, Manaus,

Amazonas, Brasil.

Título resumido: Genetic Diversity in Brazilian Philodendron

46

Resumo

O gênero Philodendron (Araceae) inclui cerca de 600 espécies, distribuindo-se endemicamente nas Américas e apresentando grande diversidade na Amazônia e na Mata Atlântica, onde os exemplares do presente estudo foram coletados. Marcadores DAF (DNA Amplification Fingerprinting) são úteis na geração de polimorfismos em nível intra e interespecífico, sendo informativos em análises de diversidade genética. No presente trabalho 12 primers foram selecionados na avaliação de indivíduos de 26 acessos de 18 espécies de Philodendron, comparados a representantes de Dieffenbachia (2 spp.) Monstera (3 spp.) e Scaphispatha (1 sp.). Todas as espécies de Philodendron estudadas pertenceram ao subgênero Philodendron, com exceção de P. goeldi e P. solimoesense do subg. Meconostigma. 1108 bandas polimórficas foram incluídas na matriz de dados para a geração de uma árvore usando o método de neighbour-joining, gerando clados com valores de bootstrap consistentes entre os Philodendron (>85%). Espécies do subg. Meconostigma agruparam-se em um ramo com espécies do subg. Philodendron. Uma associação do dendrograma a números cromossômicos disponíveis para as espécies analisadas, permitiu identificar agrupamentos de espécies com 2n=32 e 2n=34 em mais de um subramo, indicando que disploidias possam ser eventos recorrentes no gênero. As relações reveladas no presente trabalho com relação aos táxons que compõem os dois subgêneros de Philodendron são também discutidas.

Palavras chave: Meconostigma - Dieffenbachia - Monstera - Scaphispatha – Floresta Amazônica – Mata Atlântica – Números cromossômicos.

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Introdução

O gênero neotropical Philodendron Schott é um dos mais importantes da família Araceae Juss. não apenas por ser o segundo maior da família, mas também por seu importante valor comercial na floricultura, devido à beleza de suas folhagens (Coelho, 2000; Goaverts et al., 2002). Sua distribuição geográfica é bem diversificada, abrangendo principalmente áreas úmidas tropicais, como também brejos e até regiões semi-áridas (Mayo, 1988). O Brasil destaca-se como o país detentor do maior número de espécies, com grande relevância para a Floresta Amazônica e a Mata Atlântica. O gênero é dividido em três subgêneros: Philodendron, Pteromischum e Meconostigma, principalmente devido a caracteres da morfologia floral, embora apresentem características morfológicas, anatômicas e biogeográficas próprias. O subgênero com maior representação de espécies é Philodendron, seguido por Pteromischum e Meconostigma, o menor de todos (Mayo, 1988). O habitat do gênero é quase que exclusivamente epifítico, devido à presença de raízes adventícias que servem de fixação ao substrato, geralmente árvores. Entretanto, existem espécies do subgênero Pteromischum que apresentam hábito hemiepifítico lianescente. Já o subgênero Philodendron apresenta uma ampla variação de hábitos, ocorrendo espécies terrestres, aquáticas e até rizomatosas, embora o hemipifitismo seja predominante. No subgênero Meconostigma, muitas espécies apresentam hábito arborescente, como P. goeldii. Entretanto, observa-se um caráter hemiepifítico primário, por incluir plantas que germinam em árvores sem o contato primário com o solo, mas que na fase adulta são ligadas ao solo por meio de raízes (Madison, 1977; Mayo, 1986). Existem diversos estudos relacionados aos gêneros da Família Araceae bem como o gênero Philodendron, principalmente com pesquisas taxo-morfológicas, entretanto existe

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ainda uma grande carência em estudos genéticos neste gênero, uma vez que marcadores de DNA poderiam elucidar diversos questionamentos a respeito de sua diversidade molecular. O marcador molecular DAF (DNA Amplification Fingerprinting) têm sido amplamente utilizado na análise de diversidade em vegetais, principalmente por apresentar um potencial na geração de polimorfismos (Simon et al., 2007), sendo também utilizado em estudos de mapeamento genético, possuindo uma boa reprodutibilidade quando comparado ao RAPD (Winter et al., 2000; Benko-Iseppon et al., 2003). A técnica baseia-se na utilização de primers (iniciadores) aleatórios em uma maior concentração em relação a uma menor quantidade de DNA molde, uma das características principais que a diferencia do RAPD (Caetano-Anollés et al., 1991a, b; Simon et al., 2007). O presente trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade genética entre 32 acessos selecionados entre espécies dos gêneros Philodendron, Monstera Adanson, Scaphispata Schott e Dieffenbachia Schott, através de marcadores DAF avaliando a relação genética entre os taxa e populações estudados.

Materiais e Métodos

Material Vegetal As espécies selecionadas para o estudo foram coletadas em seu ambiente natural em áreas visitadas pelo grupo, incluindo a Mata Amazônica, mais precisamente na Floresta Nacional de Caxiuanã (Melgaço, PA), na Reserva Florestal Adolpho Ducke (Manaus-AM) e em uma mata urbana na Mata de Moju (Belém, PA), como também fragmentos de Mata Atlântica do Nordeste Brasileiro, como a Reserva de Gurjaú (Recife-PE). Os nomes das espécies com seus respectivos autores e locais de coleta estão listados na tabela 1.

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Todas as espécies analisadas fazem parte da coleção viva de Araceae do LGBV (Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, UFPE, Recife, Pernambuco, Brasil), sendo a maioria dos exemplares tem sido mantida em cultivo em casa de vegetação. As coletas foram realizadas pelo pesquisador Correia-da-Silva, M (Amazônia e Nordeste), sendo identificadas pela pesquisadora Soares, M. L. (INPA), sendo que ambos os pesquisadores foram licenciados pelos órgãos federais competentes (MCT/MMA/IBAMA-DF) para realização das mesmas. Além de espécimes cultivados, exsicatas de todo material coletado encontram-se depositadas no Herbário INPA.

Extração, quantificação e limpeza do DNA genômico O isolamento do DNA genômico foi feito usando entre 2,0 a 2,5 g de folhas frescas ou pontas de raízes aéreas, seguindo o protocolo descrito por Weising et al. (2004), com pequenas modificações no que tange às proporções entre tampão e massa de tecido para o protocolo Maxi-Prep, como descrevemos a seguir. Os tecidos foram macerados na presença de N2 líquido, sendo em seguida transferidos para tubos de 50 mL contendo 12 mL do tampão CTAB 2% (brometo de cetil-trimetilamônio; Tris-HCl; EDTA) previamente incubados a 60ºC por no mínimo 30 min. Foi feita uma lavagem com clorofórmio-álcool isoamílico (10 mL) numa proporção de 24:1, centrifugando a 4.000 rpm por 20 min à temperatura ambiente, sempre recuperado o sobrenadante para tubos autoclavados. No tubo contendo o sobrenadante recuperado no passo anterior, foram acrescentados 7 mL de isopropanol à temperatura ambiente, onde se misturou cuidadosamente por inversão, ficando em repouso por alguns minutos na mesma temperatura. Na seqüência, centrifugou-se a 5.000 rpm por 20 min a 4 ºC e, após esse processo, o sobrenadante foi descartado e acrescentados 10 mL de etanol 70%, invertendo-se lentamente o tubo por algumas vezes. Recentrifugou-se a 5.000 rpm por 20 min a 4 ºC e descartou-se o álcool, onde os pellets foram secados em câmara de fluxo. Após

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secagem, os pellets foram ressuspensos em 500 μL de Tris HCl a 10 mM ficando no mínimo 12 h na geladeira. A limpeza do RNA foi feita com 0,5 μL/mL de RNAse a 10 mM/uL, incubando a 37 ºC em banho-maria por 30 minutos. A quantificação do DNA foi realizada pelo método comparativo em gel de agarose a 1,2% corado com 1,5 μL de brometo de etídio (20 mg/mL) para cada 100 mL de gel, usando-se como referência diferentes concentrações do marcador padrão DNA de fago λ (20, 50, 100, 200 e 400 ηg/μL).

Geração de Fingerprinting de DNA A análise de Fingerprinting ocorreu através da metodologia de DAF (DNA amplification fingerprinting) usando-se primers aleatórios, incluindo 37 primers, sendo um octâmero, 35 decâmeros e um 15-mero (Tabela 2). As reações de DAF ocorreram conforme descrito por Winter et al. (2000), utilizando-se 0,1 ηg de DNA total, 1,5 μL de tampão de PCR 10x, 2,5 mM MgCl2, 1 mM da mistura de dNTPs, 1 μL de primer a 50 mM e 0,1 U de Taq polimerase (Fermentas), ajustando-se o volume final para 15 μL com H2O bidestilada estéril. A amplificação da reação de PCR ocorreu em termociclador eppendorf, com 2 min de desnaturação inicial a 95ºC, seguidos de 40 ciclos compostos de três etapas: desnaturação de 15 seg a 95 ºC; anelamento de 1 min a 35 ºC e alongamento por 2 min a 72 ºC. Ao final dos 40 ciclos a reação foi completada com um alongamento final de 2 min a 72 ºC, permanecendo a 4 ºC até seu processamento. O produto da reação foi submetido à eletroforese em gel de Agarose à concentração de 1,8% também corado com brometo de etídio, sendo o produto da amplificação posteriormente visualizado e fotografado com câmera integrada Sony Cybershot (5,0 Mp) em transluminador ultravioleta.

51

Seleção dos iniciadores A partir de 37 primers (Tabela 2) foram realizadas amplificações através de PCR (Polymerase Chain Reaction) pela metodologia de DAF anteriormente descrita, utilizando-se oito espécies de família Araceae, sendo cinco do gênero Philodendron (dois acessos de P. megalophyllum, e um exemplar de cada espécie P. pedatum, P. orntaum, P. imbe e P. sphalerum, bem como de taxa selecionados como representantes do grupo-externo: gênero Dieffembachia (D. elegans) e Monstera (M. dubia)). Uma amplificação de DAF encontra-se apresentada na Figura 1. O objetivo principal desta etapa foi de avaliar o grau de polimorfismo entre as amostras selecionadas e analisar a diversidade nos níveis intraespecifíco, interespecífico e intergenérico, uma vez que os primers mais informativos seriam utilizados na amostragem total.

Análise da amostragem com os primers selecionados No total 12 iniciadores considerados mais informativos (10 bandas amplificadas na proporção primer/amostras) para aplicar à amostragem completa (listada na Tabela 1), composta por 32 acessos, sendo 26 do gênero Philodendron, três do gênero Monstera, dois representantes do gênero Dieffenbachia e um do gênero Scaphispata (Tabela 3). Os procedimentos e condições para realização das reações de DAF foram idênticos ao descrito no tópico da geração de polimorfismos anteriormente para a seleção de primers. O número de bandas obtidas (referentes ao número de marcadores gerados) encontra-se anotado na Tabela 3 para melhor avaliação do poder de geração de polimorfismos de cada primer usado.

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Análise dos dados e geração da matriz de dados

Desenhou-se uma matriz de dados binários a partir da análise dos polimorfismos gerados pelas reações de DAF e baseada em bandas presentes, sendo A equivalentes às bandas presentes e C às ausentes, procedimento utilizado para o programa MEGA 4, usandose os primers selecionados. Dados duvidosos foram designados por “?” sendo excluídos da análise. A matriz de similaridade genética gerada foi analisada e agrupada pelo programa MEGA versão 4 para Windows (Kumar et al., 2007) utilizando o método neighbour-joining, com bootstrap de 1000 replicações. Números cromossômicos integrados ao cladograma foram compilados de Correia da Silva et al. (in prep).

Resultados e Discussão

Análise dos polimorfismos na etapa de seleção Foram testados 37 primers randômicos, os quais amplificaram 1228 bandas, das quais 291

foram

polimórficas

(ca.

23,7%).

Dentre

estas

bandas,

74

foram

geradas

intraespecificamente com base em dois acessos de P. megalophyllum (ARA036-CX1/2), com média de 8,62 bandas/primer. Em nível interespecífico, 122 polimorfismos foram gerados a partir das espécies de P. imbe (ARA001-CX), P. orntaum (ARA027-RD), P. pedatum (ARA005-PE) e P. sphalerum (ARA039-RD), perfazendo uma média de 17,08 bandas/primer. Por outro lado, comparando intergenericamente, as espécies D. elegans (ARA028-CX) e M. dubia (ARA076-CX), revelaram 95 amplicons, correspondendo a 7,1 bandas/primer (Tabela 2).

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Os resultados obtidos após a seleção de primers revelaram um grau de polimorfismo satisfatório, entre as seis espécies selecionadas de Araceae (dois acessos de P. megalophyllum, um acesso de cada uma das espécies P. orntaum, P. imbe, P. sphalerum e P. pedatum, como também D. elegans e M. dubia). Tais resultados apontaram também, conforme dendrograma gerado (Figura 2), que o gênero Monstera (grupo externo) despontou na fase de seleção como o grupo mais próximo de Philodendron, em detrimento de Dieffenbachia. A despeito disso, Mayo et al. (1997), classificam Dieffenbachia como sendo o segundo mais próximo de Philodendron, após Montrichardia, posicionando Monstera em outra subfamília, sendo assim um grupo bem mais distante. Tal discrepância pode ser justificada pelo fato de haver poucos representantes do grupo analisado (no caso, espécies do gênero Philodendron) na etapa de seleção de primers, tornando uma avaliação criteriosa do grupo externo menos informativa do que aquela obtida com a amostragem completa. Tal suposição foi reforçada pela análise envolvendo todos os táxons selecionados, onde Dieffenbachia ocupou uma posição mais próxima de Philodendron, confirmando as proposições da taxonomia clássica. Durante a seleção, o iniciador que mais amplificou foi o L-5 com 67 bandas, enquanto que D-7 foi o que amplificou menos, com 13 bandas (Tabela 2). O primer mais informativo foi R370-9 amplificando 19 bandas polimórficas (7,2% do total das bandas polimóficas), enquanto o primer D-5 apresentou o menor número de amplicons polimórficos (três), correspondendo somente a 1,4% (Tabela 2). Foi realizada uma análise entre o total de bandas amplificadas em relação ao conjunto de primers selecionados, observando-se que a amostra 1 (comparação intraespecífica) da espécie P. megalophyllum (subclado 2a), apresentou o maior número de bandas polimórficas (183, cerca de 57% do total das amplificações entre os dois acessos). Já entre as espécies P. megalophyllum, P. orntaum, P. imbe, P. sphalerum e P. pedatum (comparação

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interespecífica) o número de bandas polimórficas foi de 122, onde P. pedatum apresentou 185 bandas amplificadas. Quando comparados os polimorfismos entre as espécies D. elegans, M. dubia e as espécies de Philodendron, observou-se que os dois acessos (grupos externos) apresentaram 269 bandas polimórficas, representando 21,9% do total amplificado (Tabela 2). O número significativo de polimorfismos observado entre os grupos confirma o potencial do marcador DAF na análise de diversidade, tendo sido importante a etapa de seleção dos 12 primers mais informativos, que na seqüência foram aplicados num experimento envolvendo uma amostragem mais ampla, com 26 acessos do gênero Philodendron, seis de Dieffenbachia, três de Monstera e um de Scaphispata, possibilitando identificar relações de similaridade genética entre os indivíduos.

Geração de amplicons a partir de primers selecionados

Com o uso de 12 iniciadores selecionados em 32 acessos foram obtidas 2.055 bandas. O primer com maior amplificação em número de bandas foi o L-5, com 238 bandas, o qual perfez 11,35% do total geral das bandas, enquanto que o G-06 foi o menos representativo, com apenas 118 bandas (5,63% do total amplificado). Em relação exclusivamente ao gênero Philodendron, o primer com maior polimorfismo foi o W-13, com 94 bandas, perfazendo 11,57%, e o menos polimórfico foi o O-19 com somente 40 bandas com 4,93% do total. (Tabela 3). Em relação ao nível intraespecífico, o primer mais polimórfico foi também o W-13 com 24 bandas, enquanto que, o menos informativo foi o K-4, com apenas sete bandas, com um percentual de 16,42% do total de bandas comparados neste nível. No entanto, quando foi analisado interespecificamente, o primer que resultou em mais bandas polimóficas foi o L-

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14, com 72 bandas, e o O-19 com a menor quantidade de polimorfismos, mais precisamente 32 bandas, com um percentual de 56,86% das espécies analisadas, perfazendo 73,28% das bandas do gênero Philodendron em relação a toda a amostra de análise. Por outro lado, em uma avaliação intra e intergenérica, o L-14 foi o mais polimórfico com 11 e 28 bandas, e o O-19 foi menos polimórfico com uma e 12 bandas, chegando a 5,95% e 20,76% do total de bandas encontradas, respectivamente. A análise feita em todas as amostras em relação ao número de amplicons, a espécie que apresentou maior número de bandas foi o acesso 20 (P. megalophyllum) (Figura 3), com um total de 78 bandas amplificadas (3,3% do total geral), considerando os 12 primers utilizados. Por outro lado, a amostra 32 (D. elegans) revelou o menor número de bandas amplificadas (42), totalizando 1,65% quando comparadas com as demais amostras.

Diversidade Genética entre os genótipos

O dendrograma incluindo as 32 amostras (Figura 4), gerado pelo programa MEGA, revelou relações entre os acessos, gerando um grande ramo (6) incluindo todas as espécies do gênero Philodendron (com quatro grupos aqui designados como G1, G2, G3 e G4) e ramificações basais (1 a 5) incluindo os táxons do grupo externo (GE). No que tange ao grupo dos Philodendron quatro ramos (A, B, C e D), referem-se aos grupamentos indicados por G1, G2, G3 e G4, onde se formaram 16 subramos, dividindo-se em subramos ascendentes e descendentes (Figura 4). Em nível interespecífico, todas as espécies de Philodendron agruparam-se no ramo 6, com bootstrap de 97%, confirmando tratar-se de um grupo taxonomicamente coeso. Por sua vez, este grupo formou quatro subgrupos (subclados A, B, C e D). Consistente com as informações taxonômicas, indivíduos de diferentes populações da mesma espécie agruparam-

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se, como no caso de P. pedatum (3 acessos, Pernambuco, Pará e Amazonas, subramo A1’) e P. linnaei (2 acessos Pernambuco e Pará, subramo D1’’). Além disso, como esperado, diferentes indivíduos da mesma população ou de populações do mesmo estado também se agruparam com altos valores de bootstrap (Figura 4), como é o caso de P. imbe (Pará, subramo A1’’), P. melinonni (Pará, A2), P. elaphoglosoides (Amazonas, B2), P. squamiferum (Pará, D1’), P. hylaeae (Amazonas, D4’), P. megalophyllum (Pará, D4’’) e D. elegans (Pará, 5). O grupo G1 apresentou valor significativo de bootstrap (99% em A), ramificando-se em dois outros ramos (A1e A2) agrupando acessos de P. pedatum e P. imbe formados por quatro subramos A1’ e A1’’, respectivamente. O ramo H foi formado exclusivamente pela espécie P. melinonni (A2) e seus sub-ramos A2’e A2’’. A espécie P. melinonni apresenta ocorrência restrita à Mata Amazônica, apresentando hábito epifítico. O acesso 004-PA foi coletado em uma outra área de mata (Moju) impactada por fragmentos urbanos, além de apresentar entre outras diferenças, divergências morfológicas no tamanho foliar e máculas ao longo do pecíolo. Curiosamente a mesma distinção ocorreu para a espécie P. pedatum (001PA), também coletada na citada mata, apresentando hábito epifítico, separou-se das populações 001-RD (Reserva Ducke, Amazonas) e 005-PE (Pernambuco). Contudo, neste último caso não se observou qualquer contraste morfológico entre as mesmas (Figura 4). O grupo aqui designado como G2 formado pelo ramo B agrupou dois subramos B1 e B2, unindo P. fragantissimum (sect. Macrolonchium Engl.) e P. elaphoglosoides (sect. Oligospermium Engl.). Apesar de representar apenas uma população no presente estudo, P. fragantissimum (009-RD) é de ampla ocorrência, tendo sido coletada por todo Brasil (Soares, et al., 1996). Apresenta uma acentuada heterofilia quando jovem e hábito semi-epifítico em todas as áreas de ocorrência. Enquanto que P. elaphoglosoides (058-RD e 065-RD) apresenta ocorrência restrita à Amazônia, tratando-se de plantas com aspectos mais rústicos, caules e

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ramos acinzentados, de difícil cultivo fora do seu habitat natural, com folhas pequenas, porém de tamanhos estabilizados. O Grupo G3 formado pelo ramo C com a espécie P. ornatum (027-RD, seção Polyspermium Engl.), formou um ramo isolado das demais espécies, tratando-se segundo Correia-da Silva, et al. (2007) de espécie com uma arquitetura diferenciada, com heterofilia marcante, pigmentação avermelhada na extremidade posterior do pecíolo, sendo este recoberto de tecido com características aveludadas, tendo sido coletada apenas na Região Ocidental da Amazônia. Tal posicionamento configurou a referida espécie como a mais ancestral em relação aos outros genótipos. Estudos citogenéticos revelaram que a espécie possui 2n=34 cromossomos (número considerado ancestral para o gênero), além de diferenciação nos padrões de bandeamento cromossômicos, como padrões de condensação, entre esta e as demais do gênero Philodendron (Correia-da-Silva, et al. 2007). Por último, o grupo G4 constituiu-se do ramo D, quatro subramos mais ascendentes (D1, D2, D3 e D4) e quatro descendentes (D1’, D1’’, D4’ e D4’’). Tais ramos estão compostos por 13 acessos, com sete espécies pertencentes ao subgênero Philodendron e duas do subgênero Meconostigma (P. goeldi e P. solimoensense). Dentro do G4, o subramo D1 incluiu dois acessos de P. squamiferum (D1’) e duas de P. linnaei (D1’’). As duas primeiras formaram um subgrupo isolado e distante do grupo de sua seção (Schyzophyllum, e). Já as outras duas populações (D1’’) estão unidas, mesmo tendo sido coletadas em regiões distantes. O subramo D2 uniu espécies (P. solimoesense – coletada na Amazônia Oriental e P. sagitifoilum - coletada na América Central) do subgênero Meconostigma e Philodendron, respectivamente, confirmando a proximidade genética existente entre os subgêneros de acordo com Gauthier et al. (2008). Estas espécies pertencem a regiões distantes, embora a base genética entre elas se mostrasse conservada. Por outro lado, a espécie P. goeldii(subg.

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Meconostigma, D3) formou um ramo isolado das demais do mesmo subgênero do subramo D2. Esta espécie difere das demais do citado subgênero devido à sua distribuição foliar em roseta, característica peculiar entre as espécies do subgênero Philodendron. Por outro lado, o ramo D4 foi formado por dois subramos D4’ e D4’’, com a espécie P. hylaeae representada por dois acessos. As espécies agrupadas em D4’’ (P. panchyphyllum, P. megalophyllum e P. sphalerum) pertencem ao subgênero Philodendron e à mesma seção taxonômica (Oligospermium Engl.). Além disso, P. megalophyllum e P. sphalerum ocorrem em matas de baixios ou formações de platôs, enquanto P. panchyphyllum apresenta-se endêmica do Nordeste Brasileiro (Lençóis, Chapada da Diamantina, BA), habitando ambientes rupícolos em campos rupestres (Figura 4). Em relação ao nível cromossômico, o grupo G1 observa-se espécies de três seções: P. pedatum (sect. Schizophyllum Schott), P. imbe (sect. Oligospermium Engl.) e P. melinoni (sect. Macrolonchium Engl.), sendo as duas primeiras espécies com 2n=32 cromossomos e a última com 2n=30. O grupo G2 prevalece o cariótipo 2n=32. O G3 encontrou-se o padrão 2n=34. Já no grupo G4 predominou o número cromossômico 2n=34, embora P. sphalerum (D4’’) apresente 2n=32. Um dado curioso é que o super-ramo D, composto por nove espécies, pertencentes aos subgêneros Philodendron e Meconostigma (G4) agrupou a maioria das espécies com 2n=32 cromossomos (aproximadamente 55%), enquanto que as espécies com 2n=34 (P. megalophyllum e P. panchyphyllum) representaram aproximadamente apenas 45%, possivelmente, corroborando a proposição de Correia-da-Silva, et al. (2007), o qual sugere que durante o processo evolutivo do subg. Philodendron as espécies provavelmente sofreram isolamento pelo fenômeno de disploidia decrescente (2n=34, 32 e 30). Por outro lado, o G1, G2 e G3 apresentaram um maior equilíbrio em relação aos números cromossômicos, embora o número 2n=32 tenha sido o mais freqüente (quatro espécies), com 2n=30 e 34 ocorra em

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apenas uma espécie, respectivamente (Figura 4). No geral, os grupamentos indicam que a disploidia teria ocorrido independentemente em mais de um ramo no gênero Philodendron. Os grupos externos testados (GE) incluíram os gêneros Monstera, Scaphispata e Dieffenbachia (clados 1 a 3, 4 e 5), respectivamente, posicionando-se basalmente em relação ao gênero Philodendon. Porém, o gênero Monstera, curiosamente, subdividiu-se em três ramos individualizados, nos quais se observa certa coerência, uma vez que são espécies diferentes (M. obliqua, M. dubia e Monstera sp.) procedentes de ambientes distintos. Enquanto que, os gêneros Dieffenbachia e Scaphispata posicionaram-se mais diretamente ligados a Philodendron. Neste sentido, os resultados em nível intergenérico corroboraram a mais recente classificação taxonômica das Araceae (Mayo et al., 1997) e com o tipo de filogenia obtida nos estudos realizados com os marcadores moleculares AFLP (Tam et al., 2004). Finalmente, consideramos que o marcador DAF mostrou-se suficientemente informativo no que diz respeito ao índice de polimorfismo, informando bons níveis intraespecificos, interespecíficos como também intra e intergenéricos. Apesar da existência de alguns estudos genéticos envolvendo o gênero Philodendron, são necessários estudos mais aprofundados envolvendo fatores abióticos e bióticos para se ter um melhor conhecimento deste gênero, principalmente envolvendo relações biogeográficas como estudos ecológicos de espécies, a fim de revelar questões adaptativas da planta à imposição dada por algum estresse ambiental. Com isso, os marcadores moleculares podem elucidar diversos questionamentos filogenéticos, auxiliando no melhor entendimento deste gênero.

60

Agradecimentos

Agradecemos ao Ministério da Ciência de Tecnologia - MCT, através do Museu Paraense Emílio Goeldi – MPEG e Instituto de Pesquisa da Amazônia INPA, pelo apoio para as coletas, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pelo suporte dado à execução deste trabalho.

Referências

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62

2

1

3

4

Figura 1: Perfil de géis de DAF utilizando os primers: (1): P15-1, (2): OPJ-19, (3): OPD-6 e (4): OPK-4 em 8 acessos de Philodendron, Monstera e Dieffenbachia coletados das regiões da Amazônia e Mata Atlântica Brasileira.

Ara028-CX D. elegans Ara076-CX M. dubia clado 1

12

17

18

Subclado2a

clado 2 15

Subclado2b 12

GE

Ara027-RD P. ornatum G1 Ara005-PE P. pedatum Ara036-CX P megalophyllum1 Ara036-CX P megalophyllum2 Ara039-RD P. sphalerum Ara001-CX P.imbe

Figura 2: Dendrograma gerado com base na matriz gerada pela etapa de seleção de primers. A análise foi feita pelo método de neighbour joining, utilizando o programa MEGA 4 versão para Windows. Legendas: G1 e G2: espécies do gênero Philodendron; GE: Grupo externo: Dienffenbachia e Monstera.

63

G2

Figura 3: Perfil de um gel de DAF utilizando o primer OPL-14 em 32 acessos de Philodendron, Monstera, Dieffenbachia e Scaphispata coletados das regiões da Amazônia e Mata Atlântica Brasileira. Acessos especificados na Tabela 1.

64

Legenda das Seções: Schyzophyllum Oligospermium Macrolonchium Polyspermium Baursia Subg. Meconostigma

A1’

A1 A1’’

G1

A

Macrobelium Tritomophyllum

A2’

A2

Sg.1 A2’’

6 B

B1

G2

B2

G3

C D1’

D1

Sg.1 D1’’

D2

D

Sg.2

D3

G4

D4’

D4 D4’’

Sg.1

Figura 4. Dendrograma gerado pela análise de neighbour-joining usando polimorfismos de DAF com 12 primers. Legendas: GE: Grupos externos formados pelos gêneros Dieffenbachia, Monstera e Scaphispata representados pelos números (1, 2, 3, 4 e 5). G1, G2, G3 e G4: Grupos 1, 2, 3 e 4 formados pelos acessos do gênero Philodendron, formando ramos representados pelas letras A, B, C e D e subramos representados pelas letras A1, A1’, A1’ ’, A2, A2’, A2’ ’, B1, B2, C, D1, D1’, D1’ ’, D2, D3, D4, D4’ e D4’’. Sg1: Subgênero Philodendron; Sg2: Subgênero Meconostigma. A barra significa: escala de diversidade genética. * Fonte dos números cromossômicos ocorrentes no gênero: Correia-da-Silva, et al. (2007) e Mayo (apud Peterson, 1989).

65

Tabela 1. Material vegetal utilizado na análise molecular com DAF, incluindo local de coleta e número de acesso. Todas as espécies foram coletadas no Brasil, encontrando-se atualmente em cultivo na Universidade Federal de Pernambuco. Ordem taxonômica dividida em gênero e subgênero. Numeração na coluna de ordem em relação à figura 3. Abreviação: P.= Philodendron Schott; D.= Dieffenbachia; M = Monstera. Fonte dos números cromossômicos ocorrentes no gênero: Correia-da-Silva, et al. (2007) e * Mayo (apud Peterson, 1989). Gênero/Subgênero P. sbg. Meconostigma

Seção Taxonômica Baursia Reichb Macrobelium Schott Macrolonchium Engl.

Oligospermium Engl.

Polyspermium Engl. Schizophyllum Schott

P. sbg. Philodendron Tritomophyllum Schott

Dieffenbachia Monstera Scaphispta

-

Ordem 27 28 24 23 29 7 10 11 8 9 17 18 15 16 19 20 21 22 6 12 13 14 30 31 25 26 2 32 5 3 4 1

Espécies P. goeldi Barroso P. solimoesense A. C. Smith P. linnaei Kunth. P. linnaei Kunth. P. sagitifolium Liebm P. fragratissimum Kunth P. melinonii Brong. Ex Regel P. melinonii Brong. Ex Regel P. melinonii Brong. Ex Regel P. melinonii Brong. Ex Regel P. elaphoglosoides Schott P. elaphoglosoides Schott P. imbe schott P. imbe Schott P. megalopphyllum Schott P. megalopphyllum Schott P. panchyphyllum K. Krause P. sphalerum Schott P. orntaum Schott P. pedatum (W. J. Hooker)Kunth P. pedatum (W. J. Hooker)Kunth P. pedatum (W. J. Hooker)Kunth P. squamiferum Poepp. & Endl. P. squamiferum Poepp. & Endl. P. hylaeae Bunting. P. hylaeae Bunting. D. elegans Schott D. elegans Schott Monstera sp3. M. dubia Adanson M. obliqua Adanson Scaphispata sp. Schott

2n 28-48* 32 32 32 28-48* 32 32 32 32 32 32 32 32 32 34 34 34 32 34 32 32 32 32 32 32 32 34,68* 34,68* 60(24-70)* 60(24-70)* 60(24-70)* 28*

Local de Coleta Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Amazônica, Belém , Pará Mata Atlântica, Recife, Pernambuco América Central Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Mata Atlântica, Chapada Diamantina, Bahia Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Floresta Amazônica, Belém , Pará Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Mata Atlântica, Recife, Pernambuco Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Mata Atlântica, Recife, Pernambuco Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará Reserva de Adolpho Ducke, Manaus, Amazonas Floresta Nacional de Caxiuanã, Melgaço, Pará

Amostra Ara019-RD Ara046-CX Ara003-PA Ara042-PE Ara005-AC Ara009-RD Ara002-CX-1 Ara002-CX-2 Ara004-PA Ara035-CX Ara058-RD Ara065-RD Ara001-CX-1 Ara001-CX-2 Ara036-CX-1 Ara036-CX-2 Ara1106-NE Ara039-RD Ara027-RD Ara001-PA Ara001-RD Ara005-PE Ara067-CX-1 Ara067-CX-2 Ara075-RD-1 Ara075-RD-2 Ara028-CX-1 Ara028-CX-2 Ara031-PE Ara076-CX Ara084-RD Ara072-CX

66

Tabela 2. Primers utilizados na seleção, incluindo seqüência e quantidade de bandas produzidas. Número de bandas específicas (intraespecífico, interespecífico e intergenérico) quanto ao nível (monomorfismo e polimorfismo). Qtde.

Referência dos Primers

Seqüência do Primer

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Totais

L-5 N-6 B-07 15_12 R470-10 D-08 R370-9 H-03 P15-1 J-19 J-16 U03-1 B-05 O-19 G-12 G-06 D-5 N-5 K-4 W-13 R160-9 R260-10 G-08 N-11 R460-2 H-5 J-12 M-6X H-18 E-6 D-7 B-11 C-03 E-07 E-18 E-19 8_15 -

ACGCAGGCAC GAGACGCACA GGTGACGCAG AGGTCTTGGGTAGGC CGCAGACCTC GTGTGCCCCA CGCACTCGTC AGACGTCCAC GGAAGCCAAC GAGCACCACT CCACACTACC CTATGCCGAC TGCGCCCTTC GGTGCACGTT CAGCTCACGA GTGCCTAACC TGAGCGGACA ACTGAACGCC CCGCCCAAAC CACAGCGACA CGTCGTTACC GACCGACACG TCACGTCCAC TCGCCGCAAA GCAGGATACG AGTGGTCCCC TCGCCGTGGT CTGGGCAACT GAATCGGCCA AAGACCCCTC TTGGCACGGG GTAGACCCGT GGGGGTCTTT AGATGCAGCC GGACTGCAGA ACGGCGTATG CTGATGAC -

Quantidade Intra-específicas Interespecíficas Intergenéricas % de Bandas a b c d das por Primer Polim. Monom. Polim. Monom. Polim. Monom. Bandas 67 63 62 55 54 53 52 51 49 47 44 43 40 40 39 38 35 34 33 33 32 32 30 30 30 29 27 26 24 23 13 0 0 0 0 0 0 1228

0 3 0 0 5 4 6 4 3 2 5 1 3 7 3 3 1 0 3 5 3 0 1 0 0 1 2 3 3 2 1 0 0 0 0 0 0 74,0

20 8 16 16 10 9 6 8 16 10 10 12 8 8 2 6 10 10 4 6 4 12 4 8 6 4 2 4 2 2 2 0 0 0 0 0 0 245

5 4 2 6 5 2 5 3 3 3 4 3 2 3 5 5 2 5 2 4 7 6 8 5 4 2 2 4 6 3 2 0 0 0 0 0 0 122

30 30 35 25 27 23 19 19 23 23 16 15 20 15 18 12 17 14 17 8 9 11 10 13 10 13 11 5 4 11 7 0 0 0 0 0 0 510

1 2 7 3 1 3 8 1 2 4 5 6 1 2 4 6 0 3 0 6 3 0 4 0 1 1 6 5 5 3 2 0 0 0 0 0 0 95

11 16 2 5 3 12 8 13 2 5 4 6 5 5 7 6 5 2 7 3 6 3 3 2 8 8 4 5 0 2 0 0 0 0 0 0 0 168

5,5 5,1 5,0 4,5 4,4 4,3 4,2 4,2 4,0 3,8 3,6 3,5 3,3 3,3 3,2 3,1 2,9 2,8 2,7 2,7 2,6 2,6 2,4 2,4 2,4 2,4 2,2 2,1 2,0 1,9 1,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 -

67

Tabela 3. Primers selecionados para análise das 32 amostras selecionadas para este estudo, incluindo nome e seqüência dos mesmos. Análise feita a nível de polimorfismos dentro do gênero Philodendron e entre os gêneros Dieffenbachia, Monstera e Scaphispata. Primer Nº

Nome

Polimorfismos

Seqüência

Intraespecífico Interespecífico

5'→3'

total

Intragenérico Intergenérico

Philodendron

Total de

Total

polimorfismo

de bandas

1

G-06

GTGCCTAACC

15

35

50

4

22

76

118

2

G-12

CAGCTCACGA

10

51

61

6

18

85

120

3

O-19

GGTGCACGTT

8

32

40

1

12

53

200

4

J-16

CCACACTACC

17

65

82

4

24

110

171

5

J-19

GAGCACCACT

21

41

62

8

8

78

134

6

K-4

CCGCCCAAAC

7

38

45

4

15

64

138

7

K-14

CCCGCTACAC

22

51

73

6

16

95

122

8

L-5

ACGCAGGCAC

18

62

80

5

27

112

238

9

L-14

GTGACAGGCT

20

72

92

11

28

131

229

10

N-6

GAGACGCACA

8

64

72

3

22

97

235

11

N-11

TCGCCGCAAA

12

49

61

7

19

87

141

12

W-13

CACAGCGACA

24

70

94

7

19

120

209

812

66

230

1108

2055

73,28

5,95

20,76

53,91

182 %

16,42

630 56,86

68

Conclusões

1.

Dentre os táxons candidatos a grupo-externo, aqueles pertencentes ao gênero Dieffenbachia apresentaram-se mais relacionados ao gênero Philodendron, corroborando suposições da taxonomia morfológica.

2.

Dentre as espécies analisadas, P. ornatum assumiu uma posição basal, podendo tornar-se um marcador evolutivo importante do grupo Philodendron, devido às suas características morfológicas e cariológicas, sugerindo uma possível ancestralidade dentro do gênero.

3.

O dendrograma gerado revelou características peculiares, em alguns casos, unindo espécies da mesma seção taxonômica que apresentam hábitos variados, mas também separando espécies classificadas na mesma seção, sugerindo que alguns grupamentos podem ser artificiais.

4.

Espécies de Philodendron com números cromossômicos diferentes, com predominância para 2n=32 e 2n=34 agruparam-se em mais de um clado, sugerindo a ocorrência de mais de um evento de disploidia na evolução do grupo.

5.

O marcador DAF revelou que os táxons de Philodendron aqui analisados constituem um grupo monofilético, mostrando-se suficientemente polimórfico em nível interespecífico e intergenérico, enquanto o agrupamento de populações da mesma espécie em populações inclusive de regiões diferentes confirma o caráter evolutivamente informativo deste marcador.

6.

A aplicação desta técnica não apenas serve de base para o entendimento sobre as relações genéticas deste gênero, como também pode auxiliar na elucidação de diversos questionamentos na família ou em outras plantas nativas, uma vez que este marcador foi bastante útil no estudo da diversidade genética nas espécies em estudo.

69

Abstract

The genus Philodendron (Araceae) is an important element of tropical forests, including about 600 registered species endemic in the Americas and with substantial diversity in the Amazon and Atlantic forests, where the presently studied species have been collected. DAF (DNA Amplification Fingerprinting) markers are useful to generate polymorphisms especially at low taxonomic levels (within genera and among related genera). The present work 12 selected primers were able to reveal screenable polymorphisms for the evaluation of individuals out of 26 populations of 18 Philodendron species, as compared with Dieffenbachia (2 spp.) Monstera (3 spp.) and Scaphispatha (1 sp.). Most Philodendron species belonged to the large (and controversial) subgenus Philodendron, with exception of P. goeldi and P. solimoesense of sbg. Meconostigma. A total of 291 polymorphic bands have been included in the data matrix for the generation of a dendrogram using neighbourjoining analysis was able to unite all Philodendron species with consistent bootstrap value (>85%). The generated dendrogram was associated with chromosome numbers of the analyzed species, permitting a comparative evaluation of cytological trends. In general species with 2n=32 grouped together, while species with 2n=30 and 34 grouped in a separate clade. Further relationships revealed in the present work regarding the sbg. Philodendron are also discussed. Members of subg. Meconostigma grouped in a clade together with species of subg. Philodendron. An association of taxonomic entities in the dendrogram with chromosome numbers permitted the identification of species with 2n=32 and 2n=34 chromosomes in more than one clade, indicating that disploidy may be recurrent in the genus evolution. The revealed relationships regarding the analyzed taxa are also discussed. Key-words: Meconostigma - Dieffenbachia - Monstera - Scaphispatha – Amazon rainforest, Atlantic forest – chromosome numbers. 70

7. ANEXOS

71

8.1 INSTRUÇÕES PARA AUTORES

Revista Botanical Journal of the Linnean Society Print ISSN: 0024-4074 London, England

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INSTRUCTIONS FOR AUTHORS The Linnean Society publishes four periodicals: the Biological, Botanical and Zoological Journals, and The Linnean, the Society's newsletter and proceedings. The Botanical Journal of the Linnean Society publishes original papers on systematic and evolutionary botany and comparative studies of both living and fossil plants. Review papers are also welcomed which integrate fields such as cytology, morphogenesis, palynology and phytochemistry into a taxonomic framework. The Journal will publish new taxa as part of larger monographic revisions. Submissions to the Botanical Journal are now made on-line using Manuscript Central. To submit to the journal go to http://mc.manuscriptcentral.com/botjls. If this is the first time you have used the system you will be asked to register by clicking on 'create an account'. Full instructions on making your submission are provided. You should receive an acknowledgement within a few minutes. Thereafter, the system will keep you informed of the process of your submission through refereeing, any revisions that are required, and a final decision. Manuscripts submitted by other methods will not be considered. Copyright assignment Authors will be required to assign copyright in their paper to the Linnean Society of London. Copyright assignment is a condition of publication and papers will not be passed to the publisher for production unless copyright has been assigned. Authors can click here to download a copy of the copyright assignment form. Please include it when submitting a manuscript. (Please note where work is carried out by an author in their capacity as an employee of a Company, it may be the case that copyright is held by the Company. In this case it is important to ensure that someone with suitable authority within that Company signs the Copyright Assignment Form, and that you tick box B. UK government employees should tick box B, noting that the title of the copyright holder is 'Crown copyright'. Employees of the US federal government should tick box C.) OnlineOpen OnlineOpen is a pay-to-publish service from Blackwell that offers authors whose papers are accepted for publication the opportunity to pay up-front for their manuscript to become open access (i.e. free for all to view and download) via the Blackwell Synergy website. Each OnlineOpen article will be subject to a one-off fee of £1300 (equivalent to $2600) to be met by or on behalf of the Author in advance of publication. Upon online publication, the article (both full-text and PDF versions) will be available to all for viewing and download free of charge. The print version of the article will also be branded as OnlineOpen and will draw attention to the fact that the paper can be downloaded for free via the Blackwell Synergy service. Any authors wishing to send their paper OnlineOpen must complete the combined payment and copyright licence form available here (Please note this form is for use with OnlineOpen material ONLY.) Once complete this form should be sent to the Editorial Office along with the rest of the manuscript materials at the time of acceptance or as soon as possible after that (preferably within 24 hours to avoid any delays in processing). Prior to acceptance there is no requirement to inform an Editorial Office that you intend to publish your paper OnlineOpen if you do not wish to. The copyright statement for OnlineOpen authors will read: © [date] The Author(s)Journal compilation © [date] The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society

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Author material archive policy All original hardcopy artwork will be returned to authors after publication. Please note that, unless specifically requested, Blackwell Publishing will dispose of all electronic material and remaining hardcopy two months after publication. If you require the return of any of this material, you must inform the editorial office upon submission. Offprints A PDF offprint of the online published article will be provided free of charge to the corresponding author, and may be distributed subject to the Publisher's terms and conditions. Paper offprints of the printed published article may be purchased if ordered via the method stipulated on the instructions that will accompany the proofs. Manuscript preparation Authors should aim to communicate ideas and information clearly and concisely, in language suitable for the moderate specialist. Papers in languages other than English are not accepted unless invited. When a paper has joint authorship, one author must accept responsibility for all correspondence; the full postal address, telephone and fax numbers, and e-mail address of the author who is to check proofs should be provided. Although the Society does not specify the length of manuscripts, it is suggested that authors preparing long texts (20 000 words or more, including references, etc.) should consult the Editor before considering submission. Please submit your manuscript in an editable format such as .doc or .rtf. If you submit your manuscript in a non-editable format such as PDF, this will slow the progress of your paper as we will have to contact you to request an editable copy. Papers should conform to the following general layout: Title page This should include title, authors, institutions and a short running title. The title should be concise but informative, and where appropriate should include mention of family or higher taxon in the form: 'Taxonomy of the oak, Quercus (Fagaceae)'. A subtitle may be included, but papers in numbered series are not accepted. Names of new taxa should not be given in titles. Abstract This must be on a separate page. The abstract is of great importance as it may be reproduced elsewhere, and is all that many may see of your work. It should be about 100200 words long and should summarize the paper in a form that is intelligible in conjunction with the title. It should not include references. The abstract should be followed by up to ten keywords additional to those in the title (alphabetically arranged and separated by hyphens) identifying the subject matter for retrieval systems. Subject matter The paper should be divided into sections under short headings. Except in systematic hierarchies, the hierarchy of headings should not exceed three. Authors submitting papers to the Botanical Journal should consult Authors of Plant Names edited by R.K. Brummitt and C.E. Powell (Royal Botanic Gardens, Kew, 1992; ISBN 947-643-44-3).. Names of genera and species should be printed in italic or underlined to indicate italic; do not underline suprageneric taxon names. Cite the author of species on first mention. Use SI units, and the appropriate symbols (mm, not millimetre; µm, not micron., s, not sec; Myr for million years). Use the negative index (m-1, l-1, h-1) except in cases such as "per plant"). Avoid elaborate tables of original or derived data, long lists of species, etc.; if such data are absolutely essential, consider including them as appendices or as online-only supplementary material. Avoid footnotes, and keep cross references by page to an absolute minimum. References We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference management and formatting. 74

EndNote reference styles can be searched for here: http://www.endnote.com/support/ enstyles.asp Reference Manager reference styles can be searched for here:http://www.refman.com/support/ rmstyles.asp In the text, give references in the following forms: "Stork (1988) said", "Stork (1988: 331)" where it is desired to refer to a specific page, and "(Rapport, 1983)" where giving reference simply as authority for a statement. Note that names of joint authors are connected by "&" in the text. When papers are by three authors, use all names on the first mention and thereafter abbreviate to the first name et al. For papers by four or more authors, use et al. throughout. The list of references must include all publications cited in the text and only these. Prior to submission, make certain that all references in the text agree with those in the references section, and that spelling is consistent throughout. In the list of references, titles of periodicals must be given in full, not abbreviated. For books, give the title, place of publication, name of publisher (if after 1930), and indication of edition if not the first. In papers with half-tones, plate or figure citations are required only if they fall outside the pagination of the reference cited. References should conform as exactly as possible to one of these four styles, according to the type of publication cited. Burr FA, Evert RF. 1982. A cytochemical study of the wound-healing proteins in Bryopsis hypnoides. Cytobios 6: 199-215. Gould SJ. 1989. Wonderful life: the Burgess Shale and the nature of history. New York: W.W. Norton. Dow MM, Cheverud JM, Rhoads J, Friedlaender J. 1987b. Statistical comparison of biological and cultural/history variation. In: Friedlaender J, Howells WW, Rhoads J, eds. Solomon Islands project: health, human biology, and cultural change. New York: Oxford University Press, 265-281. Gay HJ. 1990. The ant association and structural rhizome modifications of the far eastern fern genus Lecanopteris (Polypodiaceae). Unpublished D. Phil. Thesis, Oxford University. Other citations such as papers "in press" may appear on the list but not papers "submitted", "in review" or "in preparation". These may be cited in the text as "unpubl. data". A personal communication may be cited in the text but not in the reference list. Please give the initials and surnames for all authors of personal communications and unpublished data. In the case of taxonomic reviews, authors are requested to include full references for taxonomic authorities. Give foreign language references in ordinary English alphabetic form (but copy accents in French, German, Spanish, etc.), if necessary transliterating in accordance with a recognized scheme. For the Cyrillic alphabet use British Standard BS 2979 (1958). If only a published translation has been consulted, cite the translation, not the original. Add translations not supplied by the author of the reference in square brackets. Tables Keep these as simple as possible, with few horizontal and, preferably, no vertical rules. When assembling complex tables and data matrices, bear the dimensions of the printed page (225 x 168 mm) in mind; reducing typesize to accommodate a multiplicity of columns will affect legibility. Illustrations These normally include (1) half-tones reproduced from photographs, (2) black and white figures reproduced from drawings and (3) diagrams. Use one consecutive set of Arabic numbers for all illustrations (do not separate "Plates" and "Text-figures" - treat all as "Figures"). Figures should be numbered in the order in which they are cited in the text. Use upper case letters for subdivisions (e.g. Figure 1A-D) of figures; all other lettering should be lower case. 75

1. Half-tones reproduced from photographs Increasingly, authors' original images are captured digitally rather than by conventional film photography. In these cases, please use settings on your equipment for the highest possible image quality (minimum 300dpi). Desktop technology now allows authors to prepare plates by scanning photographic originals and then labelling them using graphics programs such as Adobe Illustrator. These are acceptable provided: 1. Resolution is a minimum of 300 dpi at the final required image size. The labelling and any line drawings in a composite figure should be added in vector format. If any labelling or line drawings are embedded in the file then the resolution must be a minimum of 800 dpi. Please note that vector format labelling will give the best results for the online version of your paper. 2. Colour images are supplied in CMYK rather than RGB mode. 3. Electronic files are saved uncompressed as TIFF or EPS files. In the case that it is not possible to provide electronic versions, please supply photographic prints with labelling applied to a transparent overlay or to a photocopy. Grouping and mounting: when grouping photographs, aim to make the dimensions of the group (including guttering of 2 mm between each picture) as close as possible to the page dimensions of 168 × 225 mm, thereby optimizing use of the available space. Remember that grouping photographs of varied contrast can result in poor reproduction. If supplied as photographic prints, the group should be mounted on thin card. Take care to keep the surface of the prints clean and free of adhesive. Always provide overlays to protect the photographs from damage. Lettering and numbering: If supplied as photogarphic prints, letters and numbers should be applied in the form of dry-transfer ("Letraset") letters, numbers, arrows and scale bars, but not measurements (values), to transparent overlays in the required positions, rather than to the photographs themselves; this helps to avoid making pressure marks on the delicate surface of the prints, and facilitates relabelling, should this be required. Alternatively, pencilled instructions can be indicated on duplicates or photocopies marked "FOR LABELLING ONLY". Self-adhesive labels should be avoided, but if they are used, they should not be attached directly to either photographs or overlays, but to photocopies, to indicate where they are to be positioned. Labelling will be inserted electronically by the typesetter in due course. Colour: Online-only colour in figures is free of charge, however it is essential in these cases that the figure legends apply equally well to both printed greyscale and online colour versions, and do not specifically refer to the colour. Alternatively you can opt for paid full colour (see the Colour Work Agreement Form here), covering the full cost of reproduction, such that colour is used both in the hardcopy and online. In this case, legends may make reference to colour if necessary, such as for a key. If your paper is accepted and you have opted for paid full colour, we will need a completed Colour Work Agreement Form. Colour illustrations will be published free of charge provided that the colour is deemed essential by the Editor for interpretation of the figure. 2. Black and white figures reproduced from drawings These should be scanned at a minimum resolution of 800 dpi and supplied in TIFF format. Please note that JPEG, Powerpoint and doc files are not suitable for publication. If is is not possible to provide electronic versions, the figures supplied should be in black ink on white card or paper. Lines must be clean and heavy enough to stand reduction; drawings should be no more than twice page size. The maximum dimensions of published figures are 168 × 225 mm. Scale bars are the most satisfactory way of indicating magnification. Take account of proposed reduction when lettering drawings; if you cannot provide competent lettering, it may be pencilled in on a photocopy. 76

3. Diagrams In most instances the author's electronic versions of diagrams are used and may be relabelled to conform to journal style. These should be supplied as vector format Encapsulated PostScript (EPS) files. Please note that diagrams or graphs will not reproduce well in the online version of your paper unless they are in vector format due to low maximum screen resolution. Type legends for Figures in numerical order on a separate sheet. Where a "key" is required for abbreviations used in more than one Figure, this should be included as a section of the main text. Authors whose manuscripts contain large phylogenies, and who feel that these cannot be represented well in the standard page format, may opt to pay for fold-out pages as part of their article (see the Fold-Out Agreement Form here). Please note that fold-out pages will be included only with the Editor's agreement. Authors wishing to use illustrations already published must obtain written permission from the copyright holder before submitting the manuscript. Authors may, in the first instance, submit good xerox or photographic copies of figures rather than the originals. Detailed instructions on preparing illustrations in electronic form are available here. Authors may be charged for alterations at proof stage (other than printer's errors) if they are numerous. Supplementary Material Authors wishing to submit material to be hosted as online supplementary material should consult the author guidelines here. Authors should note that the Editor may suggest that figures, tables, and lists not deemed necessary for the understanding of the paper should be published online as supplementary material. Please follow these guidelines carefully: • Include all parts of the text of the paper in a single .doc or .rtf file. The ideal sequence is: (1) Header (running heads; correspondence; title; authors; addresses; abstract; additional keywords, etc.). (2) Body of article. (3) Acknowledgements. (4) References. (5) Figure Legends. (6) Tables (for each table, the legend should be placed before the body of the table). (7) Appendices. • Include all figure legends, and tables with their legends if available. • Do not embed figures in the text file • Do not use the carriage return (enter) at the end of lines within a paragraph. • Turn the hyphenation option off. • Specify any special characters used to represent non-keyboard characters. • Take care not to use l (ell) for 1 (one), O (capital o) for 0 (zero) or ß (German esszett) for ß (beta). Copyright Authors receiving requests for permission to reproduce work published by the Linnean Society should contact Blackwell Publishing for advice. Pre-submission English-language editing Authors for whom English is a second language may choose to have their manuscript professionally edited before submission to improve the English. A list of independent suppliers of editing services can be found here. All services are paid for and arranged by the author, and use of one of these services does not guarantee acceptance or preference for publication.

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